Определение активности а-амилазы.  

Реактивы; раствор 3,5-динитросалициловой кислоты.

5. динитросалициловой кислоты и 30 г сегнетовой соли растворяют в 20 мл 2 н. раствора NaOH и доводят объем до 100 мл;

2. н. раствор NaOH;

калий-натрий виннокислый (сегнетовая соль);

мальтоза (для приготовления стандартного раствора);

1/15 М раствор натрия хлорида;

1%-ный раствор крахмала (субстрат).

Оборудование: фотоколориметр.

Ход определения. Жидкость рубца разводят дистиллированной водой в соотношении 1:5. В опытную пробирку наливают 1 мл 1 %-ного раствора крахмала и ставят в водяную баню при

39. °С на 1—2 мин. Добавляют 1 мл разведенного содержимого рубца, инкубируют 20 мин. Добавляют 2 мл 3,5-динитросалициловой кислоты для прекращения реакции. В контрольную пробирку набирают 2 мл раствора 3,5-динитросалициловой кислоты, 1 мл разведенного содержимого рубца, а затем 1 мл 1 %-ного раствора крахмала и перемешивают. Обе пробирки помещают в кипящую водяную баню на 5 мин, немедленно охлаждают в проточной воде и фотометрируют при 530 нм.

Активность а-амилазы высчитывают по разнице показателей ФЭК между опытными и контрольными пробами, а затем по калибровочному графику определяют количество мальтозы, которая освободилась вследствие ферментативной реакции, по

  формул

где Е — число единиц активности сх-амилазы, выраженное в мг мальтозы; А — количество мальтозы, определенное по графику; Р — величина разведения химуса (в 5 раз); 20 — время инкубации, мин.

А ¦ 5 А

Если параметры выдержаны, то Е = = -.

Примечание.

Определение протеиназной активности содержимого рубца.

Принцип. При pH больше 5,0 а-аминокислоты реагируют с нингидрином с образованием углекислоты, альдегида и соединения, окрашенного в синий цвет, которое характеризуется максимальным поглощением при длине волны 597 нм. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна количеству аминокислот.

Реактивы: фосфатный буфер, pH 7,1;

цитратный буфер, pH 5,4;

2%-ный раствор казеина, приготовленный на 0,5%-ном растворе ЫагСОз;

0,5%-ный раствор натрия карбоната;

10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты;

0,01 н. раствор кислоты хлористоводородной (НС1);

60%-ный раствор глицерина;

1%-ный раствор нингидрина (растворяют при подогревании в цитратном буфере; реактив темного цвета необходимо очищать);

раствор «С»: к 40 мл 60%-ного глицерина добавляют 100 мл 1%-нингидрина и 40 мл цитратного буфера (готовят перед анализом).

Ход определения. В одну пробирку (опыт) вносят 4 мл раствора казеина, 1 мл фосфатного буфера и помещают в водяную баню при температуре 30 °С. Через 10 мин добавляют 1 мл разведенного в 5 раз дистиллированной водой содержимого рубца (1 + + 4), смешанного и инкубированного при 30 °С в течение 60 мин. Добавляют 4 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для прекращения реакции. Взбалтывают 10 мин, центрифугируют или фильтруют (фильтрат должен быть прозрачным).

Набирают 0,2 мл фильтрата или аликвота, добавляют 3,8 мл раствора «С», пробирки закрывают притертыми стеклянными пробками и ставят в кипящую водяную баню на 20 мин.

Пробы, окрашенные в синий цвет, охлаждают в проточной воде и фотометрируют через 10—15 мин на приборе с красным светофильтром в кювете на 10 мм. Интенсивность окраски сохраняется в течение 1 ч.

В контрольную пробирку вносят 1 мл разведенного содержимого рубца, 1 мл фосфатного буфера, 4 мл трихлоруксусной кислоты, выдерживают 10 мин в водяной бане при температуре 30°С.

Количество свободного аминного азота определяют по калибровочному графику. Для его построения берут стандартные растворы тирозина или глицина и готовят ряд растворов, которые содержат различное количество этих аминокислот (мкмоль), и дальше реакцию проводят так же, как описано выше. Активность фермента выражают в микромолях аминного азота глицина или тирозина за 1 мин на 1 г ферментного препарата (содержимого рубца), что соответствует 1 ед. активности:

где х — активность фермента, мкмоль/л; А — показатель стандартного графика; Б — степень разведения (в 5 раз); В — время инкубации (60 мин).

Источник: 1.

    Определение липолитической активности содержимого рубца.

    Принцип. Содержимое инкубируют с приготовленной эмульсией подсолнечного масла. Показателем активности ферментов является количество освобожденных свободных жирных кислот.

Реактивы: подсолнечное масло;

0,6%-ный раствор цистеина солянокислого или аскорбиновой кислоты;

желчь;

20%-ный раствор фосфорновольфрамовой кислоты;

0,01 н. раствор NaOH;

раствор Рингера—Локка: 9 г NaCl, 0,2 г ИаНСОз, 0,2 г СаС12, 0,2 г KCl, 1 г глюкозы и воды дистиллированной до 1 л;

индикатор Таширо: 40 мл 0,1 %-ного спиртового раствора метилового красного и 10 мл 0,1 %-ного спиртового раствора метиленового синего.

Оборудование: термостат; холодильник; бюретка; колбочки на 100 мл с притертыми пробками.

Ход определения. Содержимое рубца хорошо перемешивают и готовят разведение 1:10. Готовят субстратную смесь: 3 мл подсолнечного масла, 3 мл раствора Рингера—Локка, 1 мл 0,6%-ного раствора цистеина солянокислого и 3 капли желчи.

В колбочки на 100 мл (2 опытные и 2 контрольные) с притертыми пробками набирают по 3 мл раствора Рингера—Локка и 1 мл содержимого рубца. Опытные пробы ставят в термостат при температуре 39 °С на 5 ч, контрольные — в холодильник. Через каждый час пробы встряхивают 5 мин. Через 5 ч добавляют в колбочки по 3 капли 20%-ного раствора фосфорновольфрамовой кислоты и опытные пробы помещают в холодильник. Содержимое колбочек фильтруют в пробирки, добавляют по 1 капле индикатора Таширо. Опытные и контрольные пробы тестируют 0,01 н. раствором NaOH до розового цвета.

Расчет липолитической активности содержимого рубца (ЛА) ведут по формуле

где х — липолитическая активность, ед. за 1 ч инкубации; А — количество 0,01 н. раствора NaOH, пошедшего на титрование опытных проб, мл; Б — количество 0,01 н. раствора NaOH, пошедшего на титрование контрольных проб, мл; 5 — время инкубации, ч.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ КИСЛОТНОСТИ СОДЕРЖИМОГО РУБЦА

Общую кислотность содержимого рубца определяют подобно кислотности содержимого желудка или сычуга.

Принцип. К содержимому рубца в присутствии индикатора прититровывают раствор щелочи, что вызывает смену цвета.

Реактивы: 0,1%-ный спиртовой раствор фенолфталеина. 1 г фенолфталеина вносят в колбочку на 100 мл и растворяют 96%-ным этиловым спиртом. Готовый реактив хранят при комнатной температуре;

0,1 н. раствор натрия гидроксида (NaOH). Готовят из фиксана- ла, перед применением его титр проверяют 0,1 н. раствором кислоты хлористоводородной (НС1).

Оборудование: микробюретки на 2 и 5 мл; колбы на 50 и 100 мл; стаканчики или конические колбочки; пипетки на 5 и 10 мл; капельница.

Ход определения. В стаканчик или коническую колбочку наливают 10 мл профильтрованного содержимого рубца и добавляют из капельницы 1—2 капли 1 %-ного раствора фенолфталеина. В кислом растворе индикатор не изменяет цвета. При титровании из микробюретки 0,1 н. раствором натрия гидроксида цвет изменяется до розово-красного. Общая кислотность содержимого рубца определяется количеством миллилитров 0,1 н. раствора натрия гидроксида, необходимого для титрования 1 л (1000 мл) содержимого рубца (ед. титра). 1 ед. титра (ЕТ) соответствует концентрации кислот в 1 ммоль/л.

Расчет общей кислотности ведут по формуле

Л -1000 0,1

с

где х — общая кислотность, ммоль/л (ЕТ); А — количество 0,1 н. раствора NaOH, мл; 1000 — пересчет на 1 л; 0,1 — количество миллиграмм-эквивалентов щелочи •в 1 мл 0,1 н. раствора, ммоль; С — объем содержимого рубца, взятого для исследования, мл.

У клинически здоровых коров с нормальной ферментацией содержимого общая кислотность составляет 8—25 ммоль/л (ЕТ). В гиперацидном состоянии (ацидоз, непроходимость сычуга, антиперистальтика) общая кислотность возрастает до 70 моль/л (ЕТ).