Определение активности глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) в крови. 

Реактивы: 0,1 моль/л фосфатный буфер, pH 7,4.

0. ммоль/л раствор окисленного глутатиона. 134,75 мг окисленного глутатиона и 0,5 мг ЭДТА-№ растворяют в 55 мл фосфатного буфера, pH 7,6. Раствор готовят в день исследований;

5,35 ммоль/л раствор НАДФ • Н2. 11,16 мг НАДФ • Н2 растворяют в 2,5 мл дистиллированной воды. Раствор готовят перед использованием;

10 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты: 10 г ТХУ растворяют в 90 мл дистиллированной воды;

0,3 моль/л раствор фосфатного буфера, pH 8,0. 10,2 г КН2РО4 растворяют в 250 мл дистиллированной воды, 34,2 г К2НРО4 х х ЗН20 — в 500 мл воды и смешивают полученные растворы под контролем рН-метра до получения необходимого pH;

0. ммоль/л раствор реактива Эллмана: 39,6 мг 5,5-ди- тио-бис-(2-нитробензойной) кислоты растворяют в 10 мл абсолютного метилового спирта.

Оборудование: спектрофотометр; центрифуга рефрижераторная; баня водяная; холодильник бытовой; весы аналитические; рН-метр; секундомер; пипетки измерительные; пробирки химические и центрифужные; колбы мерные.

Ход определения. В химические пробирки наливают по 0,5 мл крови и добавляют по 3,5 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают и ставят в холодильник на 10—15 мин для полного гемолиза. В такие же пробирки вносят по 2 мл раствора окисленного глутатиона, прибавляют по 1 мл гемолизата крови и хорошо перемешивают.

По 1 мл надосадочной жидкости из контрольной и опытной пробирок переносят в отдельные химические пробирки и приливают по 5 мл фосфатного буфера, pH 8,0. Затем в обе пробирки прибавляют по 0,05 мл реактива Эллмана и содержимое тщательно перемешивают.

Измеряют оптическую плотность контрольной пробы по сравнению с опытной в кювете с ходом луча 10 мм при 412 нм.

Расчет активности ГР производят по формуле

А= Е- 6,05 • 106- 84 13100 ¦ 10 2 ’

где А — активность фермента, мкмоль окисленного глутатиона/л • 5 мин, Е — оптическая плотность; 6,05 — конечный объем пробы; 10 — коэффициент пересчета в мкмоль/л; 84 — фактор разведения крови; 13 100 — коэффициент малярности экстинкции ТНФА; 10 — время инкубации, мин; 2 — коэффициент пересчета на окисленный глугатион.

Клиническое значение. Наибольшая активность ГР обнаружена в почках, тонком кишечнике, эритроцитах. Играет важную роль в поддержании достаточного уровня восстановленного глутатиона (GSH) из окисленной его формы (GSSG), что позволяет обеспечить функционирование глутатионзависимых анти- пероксидантных систем. В качестве донора водорода для восстановления окисленного глутатиона главным образом используется НАДФ, но может быть использована и НАДН. Активность ГР существенным образом зависит от обеспеченности рибофлавином.

Повышение активности ГР отмечается на фоне повышения процессов ПОЛ, в частности при хроническом заболевании печени. Активность ГР в крови животных колеблется от 150 до 450 мкмоль окисленного глутатиона/л • мин.

Источники: 11, 37, 41.