МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА  

Реактивы: 0,2 ммоль/л раствор ЭДТА-Ка.

0,05 моль/л раствор тетраметилендиамина (ТЭМЭД). 0,28 мл ТЭМЭД растворяют в 40 мл 0,2 ммоль/л раствора ЭДТА-№. Реактив годен для использования через 2 ч после приготовления в течение 1 сут;

0,034 ммоль/л раствор рибофлавина. 1,3 мг рибофлавина растворяют при перемешивании на магнитной мешалке в течение 20—30 мин в 100 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в склянке из темного стекла. Годен в течение рабочего дня;

0,85 ммоль/л раствор пара-нитротетразолия хлористого (п-НТХ). 32 мг п-НТХ растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Реактив растворяется медленно, поэтому следует это делать на магнитной мешалке с подогревом до 50 °С. Хранят в склянке из темного стекла в течение 1 мес;

0,1 моль/л фосфатный буфер, pH 7,8. 1,3616 г КН2РО4 растворяют в 100 мл воды; 16,036 г Ыа2НР04 • 2Н20 растворяют в 900 мл воды. К одной части раствора калия фосфата добавляют 9 частей раствора натрия фосфата и pH определяют в помощью рН-метра;

0,1 моль/л буфер, pH 9,85. Для этого половину буферного раствора с pH 7,8 оставляют, а другую половину с помощью концентрированного раствора КОН доводят до pH 9,85;

1%-ный раствор калия йодида;

0,9%-ный раствор натрия хлорида;

хлороформ-этаноловая смесь (ХЭС) в соотношении 5 : 3 (об/об.).

Оборудование: ФЭК; лампа дневного света мощностью 40 Вт, длина трубки 1 м и более; штатив для пробирок на 20—30 гнезд в один ряд, закрытый спереди и сзади черной бумагой; весы аналитические; магнитная мешалка; секундомер; центрифуга рефрижераторная; холодильник бытовой; баня водяная; колбы мерные; пипетки с делениями разные; пробирки химические и центрифужные.

Ход определения.

Для каждой пробы берут по три химических пробирки, ставят в закрытый штатив и добавляют в них растворы реактивов и биологический материал (табл. 31).

31. Порядок приготовления растворов для определения активности КФ 1.15.1.1

N°

п/п

Реактив

Опыт,

мл

Контроль,

мл

Контроль на реактив, мл

Содержимое пробирок старательно перемешивают и штатив с ними устанавливают на расстоянии 20 см от лампы дневного света.

Во все пробирки добавляют как можно быстрее по 1 мл 1%-но- го раствора калия йодида (для остановки реакции) и сразу интенсивно перемешивают.

Измеряют оптическую плотность каждой пробы при зеленом светофильтре в кюветах с ходом луча 20 мм против дистиллированной воды.

Количество гемоглобина в гемолизатах определяют цианидным методом с помощью специальных наборов НПО «Биореактив».

Процент торможения СОД образования фармазана п-НТХ определяют по формуле

Т= Егк~ Е°" -100,

Ек~Ещ,

где Т — процент торможения реакции; Ек — оптическая плотность контрольной пробы; Еоп — оптическая плотность опытной пробы; Екр — оптическая плотность пробы контроля на реактивы; 100 — коэффициент для перевода в проценты.

Принято считать, что 50 % ингибирования реакции соответствует одной относительной единице (1 отн. ед.) активности фермента.

Количество отн. ед. активности фермента, внесенного в пробу, рассчитывают по формуле

м= 10(0,026 • Т— 1,3)^

где М — количество отн. ед. активности в пробе; Т — процент торможения реакции.

Активность СОД в пересчете на содержание гемоглобина рассчитывают по формуле

МЕ„

0,1236?гем ’

где А — активность фермента (СОД), ед. акт/мг гемоглобина; М — количество единиц фермента в пробе; Ест — оптическая плотность стандартного раствора, содержащего 59,75 мг гемоглобинцианида в 100 мл; ?гем — оптическая плотность опытной пробы гемолизата при определении гемоглобина.

Примечания. 1. Пробы гепаринизированной крови можно хранить при 4 °С не более 1 сут. 2. Химические пробирки, в которых ведется определение активности фермента, должны быть одинаковыми по диаметру, толщине стенок и цвету стекла. 3. В добавке биологического материала должна содержаться примерно 1 ед.

Клиническое значение. Супероксиддисмутазавстречается во всех клетках и является ключевым ферментом антиокси- дантной защиты в организме, которая попарно дисмутирует (превращает) супероксидные анионы в пероксид водорода и молеку- _ _ 2Н+

лярный кислород (02 + 02 + -» Н2О2 + 02) и тем самым

СОД

защищает клетки от токсичных форм кислорода в самом начале процесса ПОЛ. Активность СОД в крови и печени повышается в 1,5—5 раз во всех случаях, когда в клетках нарастает концентрация

супероксидных анионов (02 ), что наблюдается при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, легких, инфаркте миокарда и других заболеваниях сердца и сосудов, термических ожогах, болезнях печени, особенно при жировой дистрофии, при онкологических поражениях, химических отравлениях, эмоционально-болевых и других стрессах.

Снижение активности СОД отмечено при ишемии миокарда, печени, почек, скелетных мышц, хотя уровень липидных пероксидов в этих случаях возрастает. Аналогично снижается активность СОД при хроническом гепатите, фиброзе, циррозе, глубоких деструктивных поражениях печени.

Показатели активности СОД у здоровых взрослых животных и птиц колеблется от 1,0 л 7,5 ед. акт/мг гемоглобина.

Источники: 11, 26, 47.