Лабораторная работа № 34. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА СРЕДЫИНСТРУМЕНТАЛЬНЫМИ МЕТОДАМИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМФОТОТРОФНЫХ ОРГАНИЗМОВ (Методика разработана Д. А. Моториным, А. В. Смуровым и С. И. Погосяном)

Интенсивность и характер фотосинтетической активности является важнейшим показателем физиологического состояния растений. Один из способов оценки интенсивности процессов фотосинтеза — компьютеризованная флуориметрия, основанная на измерении интенсивности флуоресценции хлорофилла. Флуоресценция (слабое свечение) возникает при электронном возбуждении молекул, поглощающих ультрафиолетовый свет и испускающих затем квант света (через 10-8— 10~9с). Организмы, содержащие хлорофилл, излучают преимущественно в полосе 690 нм. При флуориметрии фактически оценивается интенсивность электронного транспорта через мембраны. Эта оценка адекватна показателям общего состояния фотосинтетической системы растений. Фотосинтетическую активность оценивают по изменению интенсивности флуоресценции хлорофилла при переходе фото- синтетического аппарата из активного состояния в неактивное. Флуоресцентный метод контроля широко используют для оценки качества среды. Так, при анализе сточных вод, без предварительной подготовки пробы и без выделения индивидуальных органических соединений, он позволяет определить суммарное количество органических веществ в воде по величине интегральной флуоресценции в области 390—560 нм.
В практике оценки качества среды применяют лабораторные и погружные флуориметры. Лабораторными флуориметрами обычно производят биотестирование образцов воды, грунта и других объектов с привлечением тестовых лабораторных культур микроводо-



рослей. Погружные флуориметры (зонды) позволяют в реальном масштабе времени получать глубинные профили водоемов по температуре, подводной освещенности, концентрации микроводорослей, фотосинтетической активности и продуктивности фитопланктона. Поскольку характер распределения концентрации фитопланктона и его фотосинтетическая активность непосредственно зависят от распределения и качества водных масс, погружные флуориметры позволяют оперативно выявлять загрязненные акватории.
Принцип действия флуориметров достаточно прост и основан на отклике природного фитопланктона или тест-культур водорослей на освещение с заданной энергией светового потока. Первая генерируемая флуориметром слабая зондирующая вспышка света с энергией 0,01 Дж обеспечивает измерение фоновой флуоресценции (/у,). На основании этого показателя можно оценить количество хлорофилла у тестируемых фототрофов. Вторая мощная вспышка с насыщающей для фотосинтеза энергией (1 Дж) дает возможность оценивать фотосинтетическую активность фототрофов. Мощное освещение приводит к восстановлению первичных акцепторов фотосистемы II и увеличению интенсивности флуоресценции до максимального уровня (F„). Флуориметр регистрирует степень индуцированного мощной вспышкой усиления интенсивности флуоресценции (Fv = F„ - Fq), что позволяет рассчитать эффективность использования света фототрофами. Измерение всех параметров производится автоматически, а результаты выводятся на экран компьютера.
Для проведения биотеста предлагается инструментальная система, близкая по основным характеристикам к зарубежному аналогу РАМ-2000 (Walz, Германия), но значительно дешевле и способна к измерению сильно разбавленных суспензий фототроф- ных тест-объектов за счет применения более чувствительной системы регистрации флуоресценции на фотоэлектронном умножителе.
Цель работы — степень токсичности природных вод из загрязненных районов по флуоресцирующей активности фототрофных бактерий Chlorella sp.
Оборудование и материалы:
флуориметр, суспензия культуры Chlorella; тестируемая вода из природного источника; донные отложения или почва; фарфоровая ступка с пестиком; дистиллированная вода; колбы на 100 мл; сушильный шкаф; кюветы объемом 10 мл; автоматические пипетки (дозаторы) на 10 и 2 мл или мерные цилиндры объемом 10 мл; технические весы.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ Для приготовления суспензий донных отложений и почв отобранную пробу высушить в сушильном шкафу при температуре 50 °С, доводя до постоянного веса. Измельчить массу в фарфоровой ступке. Сделать навеску по 5 г в трех повторностях и внести ее в колбы с 50 мл дистиллированной воды, все тщательно размешать. В экспериментальные сосуды (кюветы объемом 10 мл) внести по 8 мл культуры хлореллы и 2 мл суспензии донных отложений и тоже тщательно перемешать. Таким образом концентрация суспензии тестируемого образца в эксперименте составит 20 мг/мл.

При тестировании воды к 9 мл культуры микроводорослей в кюветы на 10 мл добавить по 1 мл тестируемого образца в трех повторностях. Контролем служат кюветы объемом 10 мл с культурой микроводорослей без внесения суспензии тестируемого образца донных отложений или воды. При проведении измерений на флуориметре возбуждение флуоресценции хлорофилла достигается с помощью тестирующих световых импульсов от 44 синих светодиодов Tl-3/4 Round (фирмы Ledtronics Inc.) с длиной волны излучения 450 нм мощностью 120 мВт. Для измерения Fm — максимальной величины флуоресценции — кювету с суспензией микроводорослей облучить в приборе, насыщающем фотосистему светом от галогеновой лампы мощностью 70 Вт через светофильтр СЗС-22. Средняя плотность мощности возбуждающего света при измерении F0 — минимальная величина флуоресценции, и Fm 0,4 и 3000 Вт • м~2 соответственно. Интенсивность флуоресценции хлорофилла, возбуждаемую тестирующими импульсами света, в приборе регистрирует фотоэлектронный умножитель ФЭУ-79 через светофильтр КС-18. Управление процессами измерения и обработки получаемой информации ведется ском- мутированным с прибором компьютером при помощи специально разработанного для этого прибора программного обеспечения. Провести измерение токсичности анализируемых образцов по схеме «контроль — опыт». Результаты занести в таблицу:
Оценка индекса токсичности донных отложений, почв или природной воды по интенсивности флуоресценции Clorella vulgaris

Тестируемый образец	Fo				Fm				г 1 vcp
	Повторности			Среднее значение	Повторности			Среднее значение
	1	2	3		1	2	3
Контроль
Суспензия донных отложений или почв
Природная вода

«Опыт» — кювета с тест-культурой Chlorella, куда добавили тестируемую воду либо водную вытяжку тестируемого образца донных отложений или почвы.
Суспензии грунтов, как правило, дают более объективные результаты, так как токсический эффект могут проявлять не только водорастворимые компоненты образцов. Однако следует иметь в виду, что взвесь частиц влияет на оценку флуоресцентных параметров водорослей. Величины параметров F0 и Fm пропорционально снижаются из-за поглощения возбуждающего света взвешенными частицами. Поэтому для оценки токсичности используют относительную величину (F„ — F0)/Fm — переменную флуоресценции, рассчитанную для опыта и контроля. Рассчитать интенсивность флуоресценции хлорофилла в исследуемых образцах донных отложений (почв) или воды. Рассчитать их индексы токсичности по формуле Fv = Fm — F0.
Выделяют три пороговых уровня индекса токсичности: I) допустимая степень — индекс токсичности меньше 20; 2) образец токсичен — индекс равен или больше 20 и меньше 50; 3) образец сильно токсичен — индекс равен или больше 50.
Сделать вывод о токсичности исследуемых донных отложений, почв или воды из природного источника.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
МаторинД. Н. Люминесценция хлорофилла в культурах микроводорослей и природных популяциях фитопланктона / Д. Н. Маторин, П. С. Венедиктов // Итоги науки и техн. ВИНИТИ, 1990. — Сер. Биофизика. — Т. 40.
Экологическая диагностика: Энциклопедия (серия «Безопасность России») / под ред. В. В. Клюева. — М.: МГФ «Знание», «Машиностроение», 2000. 

Еще по теме Лабораторная работа № 34. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА СРЕДЫИНСТРУМЕНТАЛЬНЫМИ МЕТОДАМИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМФОТОТРОФНЫХ ОРГАНИЗМОВ (Методика разработана Д. А. Моториным, А. В. Смуровым и С. И. Погосяном):

1.   ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КОРМОВ  
2.   МЕТОДЫ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КОРМОВ 
3. 4.6. Методики, разработанные А. В. Крушинским для изучения способности животных к поиску приманки, исчезающей из поля зрения
4. Использование разработанных подходов и методовдля экологической оценки микробныхсообществ наземных экосистем
5.   Количественное определение афлатоксинов В( и G( в кормах. Метод разработан Н. А. Соболевой.  
6. МЕТОДИКА ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ГИДРОМЕЛИОРАЦИИНА СУХОДОЛЬНЫЕ НАСАЖДЕНИЯ
7.   ОРГАНОЛЕПТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КОРМОВ 7.1.1. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЗЕЛЕНЫХ КОРМОВ  
8.   ОЦЕНКА КАЧЕСТВА СЕНАЖА  
9.   ОЦЕНКА КАЧЕСТВА СИЛОСА  
10.   ОЦЕНКА КАЧЕСТВА КОМБИКОРМОВ  
11.   ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЗЕРНОВЫХ КОРМОВ  
12.   ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ПРЕМИКСОВ  
13.   ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ИСКУССТВЕННО ВЫСУШЕННЫХ КОРМОВ  
14.   ОЦЕНКА КАЧЕСТВА МУЧНИСТЫХ КОРМОВ  
15.   ОЦЕНКА КАЧЕСТВА КОРМОВЫХ ЖИРОВ  
16.   ОЦЕНКА КАЧЕСТВА КОРМОВЫХ ЖИРОВ  
17.   ОЦЕНКА КАЧЕСТВА КОРМОВОЙ МУКИ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ  
18.   ГЛАВА 3 ЛАБОРАТОРНЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВИ
19. Работа организма требует соблюдения точных физических законов