Количественное определение афлатоксинов В( и G( в кормах. Метод разработан Н. А. Соболевой.  

Афлатоксин Bi относится к классу высокотоксичных соединений с ЛД50 для лабораторных животных 3—5 мг/кг. Особенно чувствительны к нему утки, индейки, форель, кролики. Афлатоксины обладают выраженным гепатотоксическим действием.

Принцип. Метод основан на экстракции токсинов из кормов водным ацетоном, очистке экстрактов от сопутствующих примесей гексаном, переэкстракции токсинов в хлороформ или бензол, их очистке на хроматографической колонке с силикагелем и алюминия оксидом и последующем определении с помощью тонкослойной хроматографии по флуоресценции в УФ-лучах.

Реактивы: ацетон (ч. д. а.); гексан (х. ч.); хлороформ для наркоза; толуол (ч. д. а.); кислота муравьиная (ч. д. а.); этилацетат (х. ч.);

натрия хлорид 4 %-ный водный раствор; метанол (х. ч.);

четыреххлористый углерод (х. ч.);

кислота уксусная (х. ч.); силикагель КСК; алюминия оксид; натрия сульфат безводный;

стандарт афлатоксина В[ производства ВНИИВСГЭ. Оборудование: готовые к употреблению пластинки для ТСХ типа «Силуфол», камера для хроматографирования; УФ-лам- па с длиной волны 365 нм; весы аналитические АДВ-200; микрошприц на 10 мкл; весы технохимические с точностью до 0,01 г; хроматографическая колонка диаметром 1,6 см, длиной 25 см; шуттель-аппарат; колбы мерные на 25, 50, 100 мл; кофемолка; цилиндры мерные на 100 и 500 мл; делительные воронки.

Ход определения.

При использовании хлороформа 25 мл его приливают в делительную воронку, аккуратно перемешивают и дают слоям разделиться. После разделения слоев нижний слой фильтруют в колбу на 250 мл через бумажный фильтр со слоем безводного натрия сульфата. Операцию переэкстракции повторяют еще трижды, каждый раз сливая нижний слой в ту же колбу. После этого промывают фильтр 10 мл хлороформа, полученный объединенный экстракт упаривают на водяной бане до 5 мл и используют для очистки на хроматографической колонке.

При переэкстракции афлатоксинов из водного ацетона в бензол в делительную воронку с экстрактом после обезжиривания гекса- ном вносят 25—30 мл бензола, встряхивают и после разделения слоев нижний слой отбрасывают, а бензольный экстракт, оставшийся в воронке, сливают в колбу на 100 мл. Делительную воронку промывают 10 мл бензола и сливают в ту же колбу. Объединенный бензольный экстракт упаривают на водяной бане, растворяют в 5 мл хлороформа и используют для очистки на хроматографической колонке.

В нижнюю часть хроматографической колонки помещают ватную пробку, вносят силикагель (высота столбика 1 см) и на силикагель наслаивают алюминия оксид (высота столбика 2,0—2,5 см), на который помещают слой безводного натрия сульфата высотой

3. см.
   Колонку по мере наполнения обстукивают для лучшего уплотнения сорбентов.

В колонку количественно переносят упаренный до 5 мл экстракт, дают ему впитаться и элюируют токсины 100 мл смеси хлороформ-ацетон (9:1). Из колбы Бунзена элюат количественно переносят в колбу Эрленмейера на 200 мл и упаривают на водяной бане до 4—5 мл. Упаренный экстракт количественно переносят в мерную пробирку на 10 мл и хлороформом доводят объем до метки (основной раствор). Полученный экстракт используют для тонкослойной хроматографии.

Тонкослойная хроматография. На пластинке отмечают линию старта в 1,5—2,0 см от нижнего края пластинки и наносят 20, 5, 2, 1 и 20 мкл из основного раствора (пробы 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно). На ту же пластинку в пятно основного раствора пробы вносят 5 мкл стандартного раствора смеси афлатоксинов и рядом наносят на пластинку пробу стандартного раствора афлатоксинов в количестве 5 мкл (концентрация афлатоксинов В і и в і в стандартном растворе должна быть 1 мкг/мл и по 0,5 мкг/мл для афлатоксинов В2 и Су. Пластинку подсушивают на воздухе для удаления растворителя и проводят последовательную хроматографию в двух системах растворителей. Сначала пластинку помещают в камеру, насыщенную парами системы толуол—этилацетат 85%-ная муравьиная кислота (5:4:1). Когда фронт растворителя поднимется на 10 см над линией старта, пластинку вынимают из камеры, подсушивают на воздухе и помещают в камеру с системой хлороформ-метанол (99 : 1) и разгоняют в том же направлении на расстоянии 13 см от линии старта[4]. Пластинку просматривают в УФ-лучах (365 нм). Ш" афлатоксинов В1, В2, в) и 02 равно соответственно 0,34; 0,29; 0,26 и 0,22.

Вместо системы хлороформ—метанол (99 : 1) можно использовать систему четыреххлористый углерод—ацетон—уксусная кислота (20 : 10 : 1). Ш" афлатоксинов в этом варианте будет 0,38, 0,35, 0,33 и 0,29 соответственно для Ві, В2, О і и Ог-

Если в пробе 4 отмечается интенсивная флуоресценция, соответствующая по величине Ш" и характеру свечения стандарту, делают разведение основного раствора в 50 раз. Для этого 0,1 мл основного раствора переносят в мерную пробирку на 5 мл и доводят объем раствора до метки хлороформом. Из приготовленного раствора на пластинку наносят 10 и 5 мкл (пробы 6 и 7) и проводят последовательную хроматографию, как описано выше. Концентрацию афлатоксинов определяют по таблице 58.

Для более точного определения афлатоксинов в образце готовят разведение основного раствора в 2, 5 и 10 раз или более и из при-

готовленного раствора наносят на пластинку постепенно увеличивающиеся в объеме пробы. После разгонки пластинки в хроматографических камерах ее проявляют в УФ-лучах, отмечая наименьший объем пробы, дающий на пластинке минимальную флуоресценцию. Концентрацию каждого афлатоксина вычисляют по формуле

1,2 -200- V 1Уп

где х — концентрация афлатоксинов В[ или 0|, мкг/кг; 1,2 — коэффициент, учитывающий потери определяемых веществ в ходе анализа; 200 — коэффициент пересчета токсина на 1 кг корма с учетом минимально детектируемых количеств афлатоксина на пластинке; V — конечный объем основного раствора с учетом разведений, мл; \?— масса навески образца, соответствующего экстракту, вносимого на колонку, г; и — объем пробы, дающий на пластинке минимальную флуоресценцию, мкл.

Клиническое значение. Обнаружение в кормах афлатоксинов в количествах, превышающих 100 мкг/кг, служит основанием для постановки предварительного диагноза на отравление этими микотоксинами, особенно в случаях отравления уток, индеек, кроликов или форели. Однако окончательный диагноз может быть поставлен по результатам анамнестического расследования (содержание в корме арахисового шрота, кукурузы, ввезенных из тропических стран) и результатов патологоанатомического вскрытия (увеличение печени и почек, гемморагии, отечность, множественные кровоизлияния, некротические очаги в печени).