Лабораторная работа №35. ИЗМЕРЕНИЕБИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ АКТИВНОСТИ ИССЛЕДУЕМЫХОБРАЗЦОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОСЕНСОРОВ (Методика разработана А. В. Смуровым и С. И. Погосяном)

Биолюминесценция широко распространена в природе и известна у бактерий, грибов, представителей разных типов животных — от простейших до хордовых. Это видимое свечение живых организмов связано с процессами их жизнедеятельности.

У многоклеточных организмов (ракообразных, насекомых, рыб) свечение часто обусловлено симбиотическими бактериями. Свечение может исходить от всей поверхности тела или его испускают специальные органы. Продолжительность свечения варьирует от длительного, продолжающегося часы до коротких вспышек, измеряемых у некоторых организмов долями секунды. Свет при биолюминесценции самых разных тонов — от голубого до красного. Биолюминесценция представляет собой один из типов хемилюминесценции: в ходе химической реакции выделяется энергия, которая не теряется в виде тепла и не сопряжена с какими-либо реакциями синтеза, а превращается в энергию электронного возбуждения молекул, способных выделять ее в виде фотонов.
Механизм биолюминесценции связан с окислением люциферина при участии фермента люциферазы.
Для целей биотестирования можно использовать различные светящиеся организмы, например морские люминесцентные бактерии. Они легко культивируются и оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за поддержание гомеостаза (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат) с быстрым, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие ксенобиотиков.
Чаще для целей биотестирования используют специальные люминесцентные реагенты (биосенсоры), приготовленные на основе живых культур светящихся организмов или выделенных (иногда из растительных объектов) люциферин-люциферазных комплексов. Интенсивность свечения измеряется специальными приборами — люминометрами. Введение в реакционную смесь пробы с токсическим соединением вызывает спад свечения (рис. 35.1).
Уровень тушения биолюминесценции пропорционален концентрации токсических веществ. На люминометре измеряется интенсивность свечения реагента до и после введения токсиканта в образце почвы или воды небольшого объема (0,2—0,5 мл). Время анализа, который можно проводить в полевых условиях на переносных люминометрах, обычно не превышает нескольких минут.
Биосенсор интегрирует эффекты смесей токсикантов, обеспечивая определение общего индекса токсичности образца. Методы биолюминесценции предпочтительны в качестве первичных тестов и способны быстро ответить на вопрос: присутствуют или нет в среде токсические агенты в концентрации, опасной для че-

Рис. 35.1. Схема динамики интенсивности свечения биосенсора при добавлении токсичного образца

ловека и других живых организмов? Биолюминесцентные методы обладают хорошей чувствительностью к разнообразным химическим соединениям, характерным для промышленных сбросов, загрязнений почвы, воды, воздуха (тяжелые металлы, фенолы, формальдегид, пестициды).
Для определения индекса токсичности необходимо проводить параллельное измерение контрольных (не содержащих токсических веществ) и опытных проб. Для большей достоверности число повторностей должно составлять не менее трех измерений.
Цель работы — оценка степени токсичности почв или воды из загрязненных районов.
Оборудование и материалы:
портативный прибор Биотоке-10; биосенсор — система «Эколюм» (см. гл. 3); исследуемая почва или вода из загрязненных районов; дистиллированная вода; холодильник; колбы на 50 мл; технические весы; автоматические пипетки (дозаторы) переменного объема 200— 1 000 мл; 9 пробирок объемом 10 мл.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ Перед началом измерений в пенициллиновый флакон с биосенсором добавить 20 мл дистиллированной (охлажденной до 3 — 5 °С) воды и тщательно встряхнуть для получения живой суспензии бактерий. Суспензию выдержать не менее 30 мин в холодильнике при температуре 0—5°С, затем довести до комнатной температуры (20—24 °С).

При исследовании почв, грунтов и донных отложений приготовить суспензии образцов или водные вытяжки.
Для этого взять навеску исследуемого грунта по 5 г в трех повторностях и размешать их в колбах с 25 мл дистиллированной воды (разведение 1: 5). При заведомо высокой токсичности образцов разведение может быть 1:10.
При исследовании морского грунта разведение делают приготовленной в лабораторных условиях на основе дистиллята (с учетом солености водоема, откуда отбирались пробы) морской водой. При исследовании воды специальной подготовки проб не требуется. В три пробирки (по числу повторностей эксперимента) разлить с помощью дозатора по 0,9 мл исследуемых образцов воды или в три другие — суспензию почв (донных отложений). В три контрольные пробирки прилить по 0,9 мл дистиллированной воды. В каждую пробирку добавить по 0,1 мл суспензии бактерий.
Измерения максимальной (/max) и минимальной (/min) ин~ тенсивности люминесценции провести сразу после приготовления серии опытных и контрольных образцов. Для более объективной оценки степени токсичности опытных образцов можно исследовать динамику изменения токсичности, проводя попарные измерения опытных и контрольных пробирок через каждые 12 ч до окончательного прекращения биолюминесцентной активности в опытных образцах (если образцы токсичны, то не более 48 ч). Результаты занести в таблицу:
Оценка индекса токсичности донных отложений, почв или природной воды по интенсивности люминесценции биосенсора «Эколюм»

Тестируемый образец	Апах				Anin
	Повторности			Среднее значение	Повторности			Среднее значение
	1	2	3	Среднее значение	1	2	3	Среднее значение
Контроль
Суспензия донных отложений или почв
Природная вода

Оценить индекс токсичности исследуемых почвы или воды из загрязненных районов по формулегде I, —
интенсивность люминесценции через время /; /тах — максимальная интенсивность люминесценции; /тш — минимальная интенсивность люминесценции.
Выделяют три пороговых уровня индекса токсичности (см. лабораторную работу № 34).
Внимание! Отклик биосенсора на токсические вещества хорошо коррелирует с таковым у других организмов, а концентрации токсических веществ, вызывающих 50 %-е тушение свечения биосенсора (ЕС50), — практически полностью соответствует 50 %-й летальной дозе (LD50) для человека.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Данилов В. С. Бактериальная биолюминесценция / В. С. Данилов, Н. С. Егоров. — М.: Изд-во МГУ, 1985.
Методические рекомендации. Определение токсичности воды и водных экстрактов из объектов окружающей среды по интенсивности биолюминесценции бактерий. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 1996.
Методические рекомендации. Определение общей токсичности почв по интенсивности биолюминесценции бактерий. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000.

<< | >>

Источник: О. П. Мелехова, Е. И. Егорова, Т. И. Евсеева. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование : учеб, пособие для сгуд. высш. учеб, заведений. 2007

Еще по теме Лабораторная работа №35. ИЗМЕРЕНИЕБИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ АКТИВНОСТИ ИССЛЕДУЕМЫХОБРАЗЦОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОСЕНСОРОВ (Методика разработана А. В. Смуровым и С. И. Погосяном):

- Геоэкология - Основы экологии - Экологический мониторинг - Экология животных - Экология насекомых - Экология почв и агроэкология - Экология птиц - Экология рыб -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -