ДИАГНОСТИКА

Выделение вируса. Первичное выделение вируса из органов абортированного плода можно проводить на 1-дневных хомячках и культурах клеток, относящихся к группам 1-3.

Взятие и подготовка материала. Наиболее подходящим материалом для выделения вируса являются легкие, печень, селезенка и тимус абортированных плодов или погибших новорожденных жеребят. При рините от больных животных ватным тампоном берут пробы выделений из носовой полости. При наличии у взрослых лошадей параличей для исследования берут кусочки головного и спинного мозга. Вирус легко изолируется из лейкоцитов экспериментально зараженных лошадей в течение 20 дн. Вскрытие абортированных плодов и павших животных производят в возможно ранние сроки. Кусочки органов и тканей массой 30-50 г вырезают с соблюдением правил асептики и сохраняют до исследования при 4°С или консервируют 50%-ным забуференным р-ром глицерина с pH 7,4. Ватные тампоны с пробками носовых выделений сразу помещают в пробирки с 2 мл р-ра Хенкса или Эрла с 20%-ной нормальной лошадиной сывороткой и антибиотиками. Кусочки органов и тканей от павших животных или абортированных плодов для гистологических исследований помещают в 10%-ный р-р формалина. Патологический материал направляют в лабораторию в термосе со льдом.

Для вирусологического исследования готовят 10%-ную суспензию мате риала на р-ре Хенкса или Эрла; надосадочную жидкость после предварительной обработки антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 500 ЕД/мл) используют для исследования. Носовые тампоны отжимают, а жидкость обрабатывают по той же методике. Все материалы до использования хранят в замороженном виде при температуре- 20-40°С.

Для выделения вируса из патологических материалов используют культуры клеток, 8- 12-дн КЭ, хомячков и мышат-сосунов 3-4-дн возраста. Чаще применяют культуры клеток, используя для их заражения суспензию из образцов легких и печени или материал смывов.

Заражение культуры клеток. При первичном выделении вирус РПЛ хорошо репродуцируется в культурах клеток почечной ткани животных различных видов и особенно в первичной монослойной культуре клеток почки лошади. Если этих клеток нет, для выделения вируса можно использовать культуры клеток почки эмбриона коровы (ПЭК), почки эмбриона свиньи (ПЭС), почки кролика (ПК). Вирус обнаруживается в наиболее высокой концентрации в легких, и именно их взвесью лучше заражать культуры клеток. В связи с тем, что при первичном выделении вируса ринопневмонии специфическое ЦПД может проявляться на 5-6-й дн после инокуляции, пробирки лучше помещать во вращающийся барабан для культур клеток, культивирование в котором сокращает сроки проявления ЦПД. Для предотвращения неспецифического токсического действия инокулируемого материала, иногда имеющего место при первичном выделении вируса, через 2 ч после заражения меняют среду. ЦПИ обычно проявляются на 3-5-й дн. Первоначальные изменения выражаются появлением округлых клеток, обладающих повышенной рефрактильностью, особенно по краям монослоя, а в более поздней стадии - гигантских многоядерных клеток, после чего наступает деструкция клеточного монослоя. При отсутствии ЦПД в первом пассаже или слабом его проявлении проводят последовательных пассажа. Каждый пассаж проверяют в РГАд с эритроцитами лошади. Контрольные культуры остаются без изменений на протяжении всего периода наблюдения. При проведении пассажа ЦПИ появляются быстрее, через 24-72 ч. Масимальные титры вируса в культурах клеток (105 - 107’5 ТЦД5о/мл) обычно обнаруживают через 3 дня после инокуляции материала. Максимальная КС активность (1:4-1:8) культурального вируса обычно проявляется на 4-5-й дн культивирования. Для повышения результативности выделения вируса рекомендуется одновременно заражать несколько видов клеток, так как дикие штаммы, даже серологически идентичные, могут обладать разной способностью к репродукции в разных клетках.

Заражение куриных эмбрионов. Используют 8-12-дн КЭ. Испытуемый материал (лучше смесь легочного и печеночного материалов от абортированных плодов) вводят по 0,2 мл в желточный мешок, аллантоисную полость или амнион. Зараженные эмбрионы инкубируют при 37°С 4 дн, ежедневно проводя овоскопию. Гибель эмбрионов в 1-е сут после заражения считается неспецифической. На 4-й дн культивирования эмбрионы вскрывают. Для последующих пассажей используют печень, сердце и мозг эмбриона.

Некоторые штаммы вируса РПЛ требуют для адаптации к эмбрионам нескольких перемежающихся пассажей: хомячки или мышата-сосуны - КЭ. После 3-4 альтернативных пассажей вирус обычно легко пассируется при серийных пересевах на ХАО. Размножение вируса в КЭ сопровождается развитием внутриядерных телец-включений в клетках эктодермы и мезодермы. Эти включения могут быть обнаружены при гистологическом исследовании препаратов, приготовленных из пораженных тканей, после фиксации их абсолютным метиловым спиртом или жидкостью Буэна и окраски гематоксилин-эозином. На ХАО часто видны макроскопически воспалительные "оспинки".

Адаптированный к КЭ вирус может нейтрализоваться иммунной сывороткой, что позволяет использовать их для постановки PH.

Заражение лабораторных животных. Беременных морских свинок заражают интрапе- ритонеально, вводя 0,5-1 мл исследуемого материала. В период между 2-20 дн. после заражения свинки абортируют или погибают. При вскрытии обычно обнаруживают некрозы в печени, петехии в легких, гастроэнтерит. Вирус легко удается выделить из абортированного плода и печени. Хомячков 3-4-дн возраста заражают интрацеребрально (доза заражения 0,

03 мл), подкожно или внутрибрюшинно (доза заражения 0,1-0,2 мл). Через 12-24 ч после интрацеребралыюго заражения хомячки погибают. При гистологическом исследовании у них обнаруживают энцефаломиелит и характерные тельца-включения. После подкожного и внутрибрюшинного заражения хомячки заболевают через 5-8 дн, причем гибнут не все животные. При вскрытии находят гепатит. При гистологическом исследовании в клетках ткани видны характерные тельца-включения. Вирус удается выделить из печени и легких. Многие штаммы вируса требуют предварительной адаптации, для чего следует проводить 2-3 "слепых" пассажа. Это особенно необходимо делать при адаптации вируса к хомячкам 4-6- нед возраста. Мышата-сосуны заболевают при различных методах инфицирования (интра- церебрально, интраназально, внутрибрюшинно). Картина заболевания у них аналогична наблюдаемой у хомячков 3-4-дн возраста, однако не все штаммы вируса удается адаптировать к мышатам, несмотря на длительные "слепые" пассажи. Метод выделения вируса на лабораторных животных требует больших затрат времени и средств и не всегда дает положительные результаты.

Заражение естественно восприимчивых животных. Проводят очень редко. Используют кобыл на 7-10 мес жеребости и молодых жеребят. Материалы вводят внутривенно, интраназально. У кобыл через 20-22 дня после заражения наблюдают признаки поражения верхних дыхательных путей и затем аборт. У жеребят через 2-3 дн развивается катаральная ринопневмония.

Индикация и идентификация вируса

Обнаружение специфических телец-включений. Эго наиболее простой, предпочтительный и легко осуществимый в практических условиях метод микроскопии мазков- отпечатков или гистосрезов, приготовленных из пораженных участков плаценты, паренхиматозных органов плода, влагалищных выделений и крови, так как вирус РПЛ вызывает образование характерных внутриядерных эозинофильных телец-включений в тканях и органах абортированных плодов (печени, легких, селезенке, слизистой оболочке носовой полости), в клетках печени хомячков, мышат-сосунов или морских свинок, зараженных материалом от больных животных, а также в клетках инфицированных культур тканей и КЭ. Наиболее подходящий для гистологического исследования материал - ткань печени. При микроскопии в положительных случаях в препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, обнаруживают многочисленные некротические фокусы и эозинофильные внутриядерные тельца-включения в клетках печени, бронхиол и альвеол.

Аналогичные тельца-включения можно обнаружить при исследовании ХАО инфицированных КЭ и культур клеток. Появление телец-включений в культуре клеток и КЭ предотвращается специфической антисывороткой. Обнаружение характерных ацидофильных внутриядерных телец-включений имеет важное диагностическое значение.

Биопроба. (См. экспериментальная инфекция и заражение лабораторных и естественно восприимчивых животных).

РГАд. Применяют для индикации вируса в культуре клеток, инфицированных испытуемой суспензией. Для этого из 4 пробирок с выраженным ЦПД сливают питательную среду, вносят по 1 мл 2%-ной взвеси эритроцитов лошади, оставляют на контакт (30-40 мин) при 37°С. Эритроциты сливают, культуру отмывают физиологическим р-ром и просматривают под микроскопом. При положительной РГ Ад идентификацию вируса проводят в РТГ Ад.

Идентификация в ИФА. Предложено выявление АГ в фиксированных формалином парафиновых срезах ткани печени абортированных плодов с использованием метода перок- с ид аза - антипероксидаза (ПАП). Данный метод подходит для выявления вируса в инфицированных тканевых культурах. Метод дот-блот-гибридизации перспективен для быстрой диагностики РПЛ и изучения патогенеза герпесвирусной инфекции лошадей (4).

Для дифференциации герпесвирусов серотипов 1-4, вызывающих заболевание со сходным симптомокомплексом, используют рестрикционный анализ ДНК вирусом по методу "отпечатков пальцев".

Серологическая идентификация

ИФ. Ею пользуются для быстрого обнаружения специфического АГ возбудителя РПЛ. В мазках-отпечатках из носовой полости вирусный АГ обнаруживается в течение 3-10 дн после заражения, а в культуре клеток - в течение 4-10 дн. Рекомендуется использовать препараты, приготовленные из легких и тимуса. Результаты ИФ коррелируют с данными вирусологических и гистологических исследований. Для идентификации вируса культуру клеток выращивают на покровных стеклах и через 2-3 дн после заражения стекла с инфицированными клетками извлекают из пробирок, фиксируют в охлажденном ацетоне и окрашивают прямым методом по общепринятой методике. В положительных случаях вирусный АГ выявляется в виде ярко-зеленого свечения в перинуклеарной зоне не менее 50% клеток при отсутствии флюоресценции в контрольных незараженных препаратах.

РТГ Ад. Применяют для идентификации вируса, который в культуре клеток вызвал положительную РГАд. Для ее постановки в 4 пробирки с зараженной культурой клеток вносят по 0,5 мл неразведенной специфической сыворотки, контакт в течение 30-40 мин при 37°С. После удаления сыворотки в пробирки вносят по 1 мл 2% взвеси эритроцитов лошади. Спустя 30 мин эритроциты сливают, культуру промывают физиологическим р-ром и просматривают под микроскопом.

РСК. Используют для обнаружения КС АГ в патологическом материале. Для индикации вирусного АГ используют ткани абортированного плода, которые замораживают и хранят при -20°С до гистологического подтверждения диагноза. АГ дтя РСК готовят из легкого или печени абортированного плода, образцы которого в замороженном состоянии сохраняют активность до 18 мес. Для приготовления АГ замороженный материал разрезают на кусочки 3-5 мм3 и несколько раз промывают холодным физиологическим р-ром для удаления гемоглобина. Берут 3-5-кратные объемы раствора. Далее материал гомогенизируют с физиологическим р-ром 1:5 и для более полной элюции вирусного АГ подвергают 3-6-кратному замораживанию-оттаиванию. Материал до использования хранят при -20°С. Непосредственно перед постановкой РСК суспензию размораживают, центрифугируют 30 мин при ЗОООмин'1, надосадочную жидкость собирают и используют в качестве АГ.

РСК ставят на холоде по методу Колмера. Для этого готовят 2-кратные разведения АГ. Сыворотку используют в разведении 1:5. Для определения единицы АГ положительные сыворотки берут в разведении 1:10. Все компоненты берут в объеме 0,5 мл. Связывание производят в течение ночи при 4°С, после чего добавляют 1 мл сенсибилизированной суспензии эритроцитов и инкубируют 30 мин в водяной бане при 37°С. Единитгя АГ в значительной степени зависит от титра сыворотки. Материал из легких абортированного плода обьино реагирует в РСК в разведении 1:8 -1:16, из печени 1:2.

PH. Ставят по общепринятой методике в культуре клеток, используя тот же вид клеток, на которых был выделен вирус. Специфическую и контрольную (отрицательную) сыворотки инактивируют при 56°С в течение 30 мин. Для идентификации выделенного вируса реакцию ставят с постоянной дозой гипериммунной сыворотки (обычно в разведении 1:20) и серийными 10-кратными разведениями вируса. В контроле вирус титруют в присутствии разведений 1:20 нормальной кроличьей сыворотки. Результаты реакции учитывают на 2, 3 и 6-е сут по ЦПД, определяя индекс нейтрализации по разнице титров вируса с гипериммунной и нормальными сыворотками и вычисляя его по методу Рида и Менча или Кербера. Вирус считают идентифицированным, если индекс нейтрализации более 2 PH можно ставить и по варианту: разведение сыворотки и постоянная доза вируса. В этом случае используют 100 ТЦД50/МЛ вируса, предварительно оттитрованного в культуре клеток. Титр выделенного вируса должен быть не менее 103 ТЦД50/МЛ. Возбудитель считают идентифицированным при наличии нейтрализации не менее чем 1/3 титра положительной сыворотки с гомологичным, заведомо известным вирусом. Можно PH проводить в виде микрометода, используюя перевиваемую линию клеток почки свиньи РК-15.

РДП. Ставят общепринятым методом в агаровом геле с АГ из печени инфицированных хомячков с заведомо позитивной и нормальными кроличьими сыворотками. В положительных случаях РДП проявляется через 48 ч после аборта.

РТГА. Ставят в макро- и микромодификации. В реакции используют свежеприготовленные или формалинизированные эритроциты лошади. Методика постановки общепринятая. Специфические гипериммунные сыворотки для РТГ А те же, что и для PH и РСК. Идентификация вируса - наиболее простой, доступный и быстро выполнимый метод.

ELISA Выявляют АГ через 12 ч после заражения культуры клеток (почки кролика), титр которого достигает пика к 24 ч. Титры АГ в ELISA несколько ииже титра его инфекционности. Разработан непрямой метод ELI S А для выявления активности. Титр активности в ELISA превышал титры PH в 300-500 раз. Коэффициент корреляции между ELISA и PH составлял 0,815.

Рестрикционный метод индикации вируса. Был успешно испытан на 297 изолятах, из которых 272 были получены от абортированных плодов и 25 - от животных с поражением респираторного тракта, отличались по типу рестрикции ДНК от изолятов, выделенных от абортированных плодов, что явилось основанием для вьщеления 2-х подтипов вируса. В пределах каждого из подтипов выделено по 13-16 различающихся по рестрикции образцов.

ПЦР. Высокочувствительный метод диагностики, с помощью которого удается обнаружить ГВЛ в патологическом материале даже когда в 105-106 клеток было не более одного генома вируса. ГВЛ типа 1 способен длительное время находиться в лейкоцитах в латентном состоянии (6).

Серодиагностика и ретроспективная диагностика

Диагноз на прошедшую инфекцию обычно ставят при помощи PH в культуре клеток, на КЭ, хомячках или мышатах-сосунах, определяя титры АТ в сыворотках крови лошадей или индексы нейтрализации. Для ретроспективной диагностики используют РСК. Лучше исследовать парные сыворотки: одну, взятую в начале болезни, другую - через 3-6 нед. PH обычно дает более высокий процент положительных результатов, чем РСК. При проведении регулярных обследований отмечают значительные колебания титров АТ, несмотря на отсутствие у животных клинических признаков болезни.

Появление КСА отмечают на 7-10-й день после заражения, титры их нарастают и достигают максимума к 14-20-му дню, удерживаются на этом уровне до 30-го дня, а затем постепенно снижаются. Через 3-6 мес после заражения большинство взрослых животных реагируют отрицательно. У жеребят КСА сохраняются в течение 1-4 мес после перенесенной болезни. Титры их могут колебаться от 1:4 до 1:64 и выше, но наиболее часто не превышают 1:8-1:16; титры КСА 1:4 и выше, а также ВНА 1:100 и выше указывают на длительное течение болезни. Титры АТ в РСК 1:16 и выше свидетельствуют о недавней инфекции. Результаты PH при оценке недавно перенесенной инфекции менее точны, чем результаты РСК. ВНА появляются позднее и удерживаются на одном уровне более длительно. На протяжении 2-

3 нед после инфицирования они могут с нулевого уровня достигнуть титра 1:100 и выше и удерживаться без существенных колебаний на протяжении 6-12 мес.

Кроме диагностической ценности, массовые серологические исследования позволяют получить данные о степени инфицированности данной популяции лошадей. В этих целях чаще всего используют РСК и PH в клеточных культурах. Следует иметь в виду, что серологические методы не имеют диагностической ценности при исследовании сывороток абортировавших кобыл. Объясняется это тем, что аборт наступает обычно спустя 1-3 мес после инфицирования дыхательных путей кобылы и к этому времени титр КСА уже снижается, а титр ВНА остается примерно на том же уровне. Присутствие вируса в плоде не вызывает у кобылы увеличения титра АТ.

PH. При наличии адаптированных штаммов вируса она может быть поставлена в культуре клеток, на КЭ, хомячках или мышатах-сосунах (в зави сим ости от адаптации вируса). Наиболее часто реакцию ставят в культуре клеток почки лошади или теленка. Для постановки PH в культуре клеток используют вирус, хорошо адаптированный к ней. Перед постановкой реакции культуральный вирус центрифугируют 30 мин при 2500-3000 мин1. Для стабилизации активности его хранят до использования в замороженном состоянии при -30-40°С. Для проведения PH на хомячках или мышатах-сосунах используют гомо- генат печени хомячков или мышат, погибших через 14-24 ч после заражения вирусом. Суспензию гомогентата печени (20%-ную) на забуференном физиологическом растворе pH 7- 7,2 центрифугируют 20 мин при 3000 мин'1, надосадочную жидкость отсасывают и добавляют к ней 20% нормальной сыворотки лошади. Полученный вирус хранят при 4°С. При этих условиях он активен без снижения титра в течение 2 нед.

При постановке PH на хомячках или мышатах-сосунах используют штаммы вируса, адаптированные к этим животным. Реакцию ставят с серийными 10-кратными разведениями вирусного материала и неразведенной сывороткой, в равных объемах. После контакта в течение 1 ч при комнатной температуре смесь в дозе 0,2 мл вводят мышатам или хомячкам внутрибрюшинно. Контрольным животным вводят смесь вируса с нормальной сывороткой лошади. За животными наблюдают в течение 7 дн. Если в испытуемых сыворотках есть АТ, животные выживают, а контрольные погибают через 3-5 дн после инокуляции при наличии характерных изменений в печени. Аналогичным образом ставят PH на КЭ, используя штаммы вируса, адаптированные к КЭ. Смесь вируса с сывороткой после предварительной инкубации в течение 1 ч при 37°С вводят на ХАО КЭ 8-12-дн возраста в дозе 0,2 мл и инкубируют их при 37°С 4 дня. О защитном действии сыворотки судят по сохранению жизнеспособности эмбрионов.

РСК. При определен™ КСА в качестве антигена используют печень хомячков, зараженных адаптированным к ним штаммом вируса и погибших через 18-24 ч после заражения. Сыворотки крови лошадей инактивируют неразведенными, прогревая их 30 мин в водяной бане при 60°С.

При постановке РСК для определения титра АТ в сыворотках используют 3-4 ед. АГ. РСК ставят на холоде по общепринятой методике. В качестве антигена для РСК также используют культуральный внутриклеточный вирус, концентрированный уменьшением объема питательной среды при культивировании и обработкой карбоваксом.

РТГА. Исследуемые парные сыворотки перед исследованием инактивируют при 56°С 30 мин. Реакцию ставят микрометодом с применением аппарата Такачи. В качестве АН используют вакцинный штамм вируса, который размножают в культуре клеток. РТГ А ставят с 4-ед. ГА, с 0,2%-ной взвесью эритроцитов лошади по общепринятой методике. Результаты учитывают через 2 ч. Титром АТ в сыворотке считают наибольшее разведение ее, при котором отсутствует агглютинация эритроцитов. Ретроспективный диагноз на РПЛ ставят при 4-кратном приросте АТ в парных пробах сывороток животных-реконвалесцентов. Обычно АТ к ГА вируса РПЛ у переболевших лошадей выявляются в высоком титре - 1:128-1:512.

ЕЫБА.Титры АТ в экспериментально зараженных кроликов достигали 1:120000 и 1:.665000, а у пони 1:60000. При этом титры ВНА в тех же пробах сыворотки были ниже и лишь незначительно повышались при постановке PH с добавлением комплемента. Различие титров в ELISA и PH объясняется тем, что в первой реакции выявляются и ВНА, и АТ, направленные против внутренних компонентов самого вируса.

Дифференциальная диагностика

Проводится по данным исследования вируссодержащего материала (биопробы, серологические реакции с типоспецифическими сыворотками). Необходимо исключить инфекционный аборт паратифозной природы и аборт, вызываемый вирусом артериита лошадей. Возбудители РПЛ и артериита вызывают сходные клинические симптомы аборта, но серологически они различны: нет АГ родства. Кроме того, артериит протекает тяжелее, чем РПЛ, и вызывает более глубокие изменения во внутренних органах, отеки живота, конечностей и часто гибель животных. При нем не образуются характерные внутриядерные тельца- вюпочения. Грипп лошадей отличается высокой контагиозностью, быстрым распростране-

42 Зак. Nfl 171 геп нием, наличием сухого, часто болезненного кашля, при этом у жеребых кобыл, как правило, отсутствуют аборты. Инфекция, вызванная аденовирусом, регистрируется обычно у жеребят раннего возраста. В связи со сходством клинического проявления эти болезни дифференцируют на основании лабораторных исследований. При дифференциации от абортов бактериальной этиологии, которую оценивают на основании бактериологических исследований, следует иметь в виду, что при вирусной ринопневмонии в 25-45% случаев выделяют различную сопутствующую и секундарную микрофлору.