ДИАГНОСТИКА

Лабораторная диагностика ВД-БС включает: 1) обнаружение в патологическом материале (мазках, отпечатках, срезах), полученном от больных животных АГ в РИФ; 2) выделение возбудителя из патологического материала в культуре клеток ТБ, ПЭК или ЛЭК и его идентификация в PH или РИФ; 3) выявление АТ в сыворотке крови бальных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в РСК и PH.

Лабораторную диагностику ВД-БС проводят с использованием набора диагностикумов (ТУ 4621-529-79), выпускаемых биологической промышленностью. Ее ведут параллельно с исследованием материала на ПГ-3, аденовирусную (адено 1 и 2), РС и ИРТ.

Предварительный диагноз на ВД-БС КРС ставят на основании положительных результатов обнаружения АГ в патологическом материале в ИФ и ПЦР с учетом эпизоотологиче- ских и клинических данных, а также патологоанатомических изменений. Окончательный диагноз ставят на основании: совпадения результатов ИФ с ПЦР, выделением и идентификацией вируса; совпадения результатов ИФ с обнаружением АТ в 30% н более вторых проб парных сывороток в титрах не ниже 1:4 в РСК и 1:16 в PH; обнаружения 4-кратного и более прироста АТ в парных пробах сывороток.

Выделение вируса.

Взятие и подготовка материала. В лабораторию направляют патологический материал от больных животных, взятый в первые 2-3 дня при выраженных симптомах болезни, илн от животных, убитых с диагностической целью в острой стадии заболевания. От больных животных берут 15-20 проб следующего материала: смывы со слизистой оболочки носовой полости, получаемые путем введения стерильного ватно-марлевого или поролонового тампона в носовые ходы; пробы крови в первые 3 дн болезни и через 3 нед от тех же животных с соблюдением правил асептики в стерильные пробирки по 8-10 мл, соскобы с изъязвленных или эрозированных участков слизистых оболочек ротовой полости и носового зеркала, взятые жесткими ватно-марлевыми тампонами или скальпелем. Тампоны с материалом помещают в стерильные пенициллиновые флаконы илн пробирки с 2-3 мл стерильного физиологического р-ра или р-ра Хенкса, содержащего 500-1000 ЕД/мл антибиотиков (канамицина, мономицина, неомицина, пенициллина, стрептомицина и др.). Из крови после свертывания стерильно сливают 3-4 мл сыворотки и доставляют в лабораторию.

От животных, убитых с диагностической целью, берут с соблюдением правил асептики кусочки легких с бронхом (на границе пораженного и здорового участков), селезенки, средостенные, бронхиальные и брыжеечные лимфоузлы, миндалины, пораженные участки слизистых оболочек носовой и ротовой полостей, трахеи, ЖКТ, а также пробу крови. Кусочки материала массой до 20 г помещают в стерильную, плотно закрывающуюся посуду. Легче вирус выделить в начале болезни и в период обострения из крови, легких, различных участков тонкого кишечника (в особенности из клеток слизистой оболочки 12-перстной кишки), лимфоузлов и селезенки. При хроническом течении болезни его удается регулярно выделять из разных отделов кишечника, но не из крови. Исследование носовых смывов и фекалий в этих случаях также дает отрицательные результаты, хотя в отдельных случаях вирус удавалось выделять из фекалий даже через 5 мес после болезни.

Заражение культур клеток. Вирус выделяют в первичных субкультурах клеток эмбриона КРС (ПЭК, ЛЭК, СЭК) или ТБ. Изолят считается выделенным в случае, если он вызывает стабильное однотипное ЦПД не менее чем в 2-х последовательных пассажах. В этом случае возможна его идентификация в PH. В первичных культурах клеток почки эмбриона коров первые ЦПИ обнаруживают через 2-5 дн после инокуляции. Они выражаются в появлении мелкозернистой инфильтрации в клетках фибробластоидного типа. По мере развития инфекции клетки постепенно отторгаются от поверхности стекла, но некоторые долго сохраняются, образуя островки клеток эпителиоидного типа. В конце концов на стекле остается только сеть зернистого материала.

При использовании вторичных культур клеток цитопатические изменения появляются почти одновременно во всех клетках монослоя, причем они становятся удлиненными, угловатыми и кажутся переплетенными. В окрашенных препаратах клеточного монослоя при наличии цитопатических изменений обнаруживают вакуолизацию протоплазмы и изменение ядер, выражающиеся в сокращении мембраны, пикнозе и кариорексисе. В некоторых случаях вакуолизация бывает так выражена, что ее наблюдают при микроскопии неокрашенных препаратов. Развитие ЦПИ не соответствует возрастанию титра вируса. К 72-96 ч после инокуляции, когда титры вируса достигают максимума (105,5-106,5 ТЦД50), отмечают лишь начало ЦПД. При отсутствии ЦПД в 3-х последовательных пассажах клеток 4-й пассаж проводят с попыткой выявления вируса в монослойной культуре на покровных стеклышках в ИФ. При отрицательной реакции дальнейшее исследование прекращают. Однако отрицательный результат в этом случае не дает права на постановку диагноза. Для идентификации таких штаммов японские исследователи предлагают использовать феномен экзальтации вируса БН в присутствии возбудителя ВД-БС. Сущность метода сводится к появлению ЦПИ при совместном выращивании этих агентов в культурах клеток тестикулярной ткани КРС (18). Методика исследования заключается в следующем. Диспергированные трипсином клетки тестикулярной ткани КРС суспендируют до концентрации 2- 10б клеток в 1 мл в 0,5%-ном р-ре ГЛАХ с сывороткой КРС, проверенной на отсутствие ВНА к возбудителю ВД-БС. Суспензию распределяют по 0,5 мл в пробирки. В каждую из них инокулируют по 0,1 мл вирусного материала (разведенного ВД) и инкубируют при 37°С в наклонном стационарном положении. В качестве контроля в каждый опыт включают не инокулированные культуры. После 4 дн инкубирования жидкость удаляют, а культуры заражают вирусом БН (Ю6БОЕ в 0,5 мл среды). После дополнительного 3-дн инкубирования при 37°С культуры исследуют на наличие ЦПД. В культурах, первоначально инфицированных нецитопатоген- ным штаммом ВД, после заражения вирусом БН появляется четко выраженные ЦПИ. В контрольных культурах один вирус БН обычно не вызывает ЦПИ. Незараженные культуры, в которые не вводили ни одни из вирусных агентов, должны оставаться нормальными.

Для пассирования не цитопатогенных штаммов культуры, инокулированные вирусом диареи каждого пассажа, инкубируют 3 дн при 37°С, после чего собирают культуральную жидкость, которую используют для дальнейших пассажей, а культуры инфицируют вирусом БН и дополнительно инкубируют для индикации ВД при помощи феномена экзальтации.

Заражение телят. Биопробу на телятах ставят в тех случаях, когда попытки выделить специфический вирус оказались безуспешными или возникает сомнение в его наличии в связи с тем, что в зараженных культурах клеток нет ЦПИ. Используют телят 2-6-мес возраста, проверенных на отсутствие ВНА к ВД, или телят 4-6-дн возраста, полученных из благополучного хозяйства. В качестве материала для заражения используют культуральную жидкость 3-5 пассажей, 5-10 мл которой вводят внутривенно. Если в исследуемом материале есть вирус диареи, у телят на 4-7-й день после заражения отмечают повышение температуры, лейкопению, появление слизистых истечений из носовой полости и диарею; у некоторых животных могут отмечаться тенезмы. В случае положительного результата у зараженных животных вирус сравнительно легко удается выделить из крови. В наибольшей концентрации (103-105 ИД50/Щ,) вирус обнаруживают через 4 дн после заражения, хотя присутствие его в крови подтверждается на протяжении 15 дн.

Серологическая идентификация

ИФ. Аналогична таковой при диагностике аденовирусной инфекции. Этим методом АГ ВД обнаруживают в клетках слизистой оболочки прямой кишки, селезенки, легких и лимфоузлов экспериментально зараженных животных. Изучено распределение АГ ВД-БС в тканях животных остром и хроническом течениях болезни. В лимфоидных тканях АГ располагается в клетках системы фагоцитирующих мононуклеаров. Между первоначальным обнаружением АГ в слизистой кишечника, кератинизированном эпителии верхних отделов пищеварительной системы и кожи и прогрессированием патологических признаков имеется скрытый период.

ИФ биопсийного материала слизистых оболочек ротовой и носовой полостей пригодна для ранней прижизненной диагностики вируса диареи. ИФ для обнаружения АГ вируса в клетках из носоглоточных смывов - надежный и быстрый способ выявления животных, персистентно инфицированных вирусом. При исследовании препаратов обращают внимание на свечение АГ в цитоплазме не разрушенных клеток. Яркая зеленая флюоресценция в виде гранул или диффузного свечения цитоплазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего количества исследованных проб. Удобным оказался непрямой метод ИФ с использованием конъюгированных Fab-фрагментов АТ из гиперим- мунной свиной сыворотки против ВД-БС КРС. Специфическая флюоресценция вирусного АГ в культуре бычьих макрофагов обнаруживалась в цитоплазме клеток. Для идентификации не цитопатогенных изолятов метод ИФ практически единственный. При наличии ЦПД в культурах клеток, зараженных изолятом, и положительной флюоресценции проводят окончательное типирование вируса в PH.

PH. Это основной метод идентификации вируса. Новые изоляты возбудителя ВБ-БС, не обладающие цитопатогенной активностью, могут быть идентифицированы при помощи ги- периммунной сыворотки к вирусу диареи по подавлению феномена экзальтации вируса НБ, который используют для индикации подобных штаммов.

РДП. Обеспечивает быструю и точную постановку диагноза, однако пока чувствительность метода невелика, и его следует использовать в комплексе с другими методами лабораторной диагностики и идентификации возбуди теля. Приготовление испытуемого АГ и методика постановки РДП описаны ранее (15, 16). Антисыворотку для РДП готовят на КРС. Для иммунизации животных используют цитрированную кровь, взятую асептически от экспериментально зараженных животных в период подъема температуры. Кровь вводят внутривенно (некоторым животным делают несколько таких инъекций). Кровь берут через 60-90 дн после инокуляции.

Выявление вируса ПЦР. Данный метод рекомендован для быстрой диагностики ВД- БС. После цикла обратной транскрипции образцы ткани инфицированной культуры клеток подвергают амплификации с использованием праймеров, обеспечивающих репликацию определенного сегмента гена белка gp48 ВД. Для обнаружения амплифицированных последовательностей используют электрофорез в ПААГ и гибридизацию с б иотинилированным ДНК-зондом на последовательности генома вируса лейкоза (35, 89). При идентификации молочных стад, инфицированных вирусом ВД-БС КРС, также предложен метод ПЦР для работы с пробами молока. Вирусную ДНК выделяют из соматических клеток цельного молока методом экстракции изотиоцианатом гуанидина и фенолом-хлороформом. При острой инфекции РНК вируса обнаруживалась через 6-10 дн после заражения, а при хронической - с использованием обоих праймеров (5'-нетранслируемая область (S'-HT) и область р80) до разведения молока 1:640. ПЦР оказалась в 14,6 раза чувствительнее других методов выделения вируса Для выяснения РНК ВД методом ПЦР необходимо не менее 580 соматических клеток, тогда как для выделения вируса - не менее 8500 клеток. Чувствительность и специфичность ПЦР подтверждена гибридизацией по Соузерену (132а). Чувствительность метода превышает чувствительность выделения вируса в культуре клеток в 102-104 раза. Показана возможность обнаружения персистентной инфекции ВД-БС КРС методом ДНК- гибридизации и ПЦР (47).

Биотинилированные зонды комплементарной ДНК уже широко используются для обнаружения пестивирусов (КЧС, ВД-БС КРС и ПБО) (66). В Бельгии разработан метод обнаружения специфических АТ к ВД с помощью ИФА, проводимого с рекомбинантным АГ и монАТ (101). ИФА с монАТ удобен для выявления виремии у животных; с его помощью в лейкоцитах обнаруживали 2 родственных неструктурных белка (р80К и р120-130К). Вирусный АГ был обнаружен в В- и Т-лимфоцитах, моноцитах (74). Помимо общепринятого метода ИФА предложена иммуноферментная реакция захвата АГ ВД КРС в лимфоцитах периферической крови КРС. В реакции для захвата АГ используют монАТ к консервативному АГ домену неструктурного белка (р125/р80) ВД (85).

Кроме ИФА разработан и предложен метод взаимодействия специфической антисыворотки с вирусным АГ ВД в лимфоцитах инфицированных животных с помощью проточной цитометрии. Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Для повышения чувствительности реакции лимфоциты фиксируют, их клеточные мембраны солюбилизируют, и вирусный АГ выявляют при использовании биотинилированных Ig из антисыворотки свиней с последующей инкубацией с ФИТЦем, конъюгированным авидином (122).

ИФА. ИФА позволяет легко идентифицировать культуры клеток, инфицированные ВД. Идентификация с помощью монАТ в практическом диагностическом применении не разработана. Однако получено 5 монАТ (XI А9, АЕЗЕ2, AM2G5, ВТ48, BT6G9) против вируса ВД-БС КРС с ВН-активностью, которые позволили разделить изоляты ВД на 4 группы. Получена и изучена панель монАТ против Singer-изолята, с помощью которой были обнаружены полипептиды мол.м. 56-58 кД и доказано, что гликопротеин, локализуется на поверхности вирионов и является носителем нейтрализующих эпитопов. Анализ с панелью монАТ показал АГ гетерогенность среди изолятов этого вируса (70).

Серодиагностика и ретроспективная диагностика

Серодиагностика заболевания затруднительна, так как при хроническом течении инфекции АТ обнаруживаются непостоянно и бывают в невысоких титрах (29). Диагноз на прошедшую инфекцию, а также латентное вирусоносительство обычно ставят при помощи PH в культуре клеток, определяя титры АТ в сыворотках реконвалесцентов. Для этого лучше исследовать парные сыворотки, взятые с интервалом 3-4 нед. При диагностике скрытого течения инфекции чаще используют сыворотки крови убойного скота, поступающего с клиникой не диагностированной инфекции кишечного и респираторного трактов. Обычно в таких случаях процент положительных сывороток (титры от 1:16 до 1:128) варьирует в широких пределах и может достигать 30-50 (иногда до 80). У клинически здоровых животных процент положительных проб может колебаться от 6-8 до 20-30. Динамика появления и угасания титров ВНА недостаточно изучена. Перед исследованием сыворотки прогревают в водяной бане при температуре 57-58°С 30 мин.

В США разработан быстрый количественный метод титрования ВД КРС. Он состоит в микротитровании с использованием цитопатогенных и не цитопатогенных изолятов вируса и перевиваемой линии клеток бычьей почки - МДВК. Для этого серийные разведения вируссодержащей жидкости и суспензию клеток в концентрации 1105 в среде с 2% сыворотки крови лошади заливают в лунки пластин Тerasaki и проводят микротитрование в НИФ, которую учитывают на дне лунок пластин, используя водно-иммерсионный объектив микроскопа. Вирус также титруют и по бляшкообразованию. Специфическую флюоресценцию в клетках наблюдали уже через 12 ч после заражения, окончательные результаты считали через 72 ч инкубирования. Результаты титрования вируса по бляшкам и в микротитровании совпадали. Микротитрование вируса по ИФ имеет ряд преимуществ над стандартным методом титрования по бляшкам: требует меньше времени и материалов и особенно незаменимо при титровании не цитопатогенных изолятов ВД (137).

PH. Её ставят методом разведения испытуемых сывороток с постоянной дозой стандартного вируса в культуре клеток ПЭК или ТБ. Положительными считают сыворотки с титром АТ 1:16 и выше, в парных сыворотках - повышение титра АТ во второй пробе в 4 раза и более. При экспериментальном заражении у всех телят через 15-61 день обнаруживали ВНА в титре 1:64 - 1:1024. Реакция, суть которой заключается в подавлении образования бляшек АТ исследуемой сыворотки, оказалась пригодной для серологических исследований при ВД-БС. После получения гомогенного слоя клеток культуру промывают 1 раз фосфатным буферным р-ром и заражают 15 мл суспензии вируса в таком разведении, чтобы в 1 мл ее содержалось около 20 БОЕ. После адсорбции вируса при 37°С в течение 30 мин суспензию отсасывают и наносят на культуру 15 мл агара. После застывания агара на его поверхности раскладывают кружки фильтровальной бумаги, насыщенной неразведенной исследуемой сывороткой. После 4 дн инкубации при 37°С учитывают результаты. Доказательством того, что исследуемая сыворотка содержит АТ, служит отсутствие повреждения слоя клеток вокруг насыщенного ею кружка фильтровальной бумаги, что обнаруживается в виде венка клеток.

РСК. Ставят микрометодом с использованием микротитратора Такачи или Титертека. При их отсутствии возможна постановка РСК в пробирках в общем объеме 0,5 мл (17,18).

РДП Не нашла широкого применения в ветеринарной диагностической практике при обнаружении АТ в сыворотках животных. ПА появляются в сравнительно поздние сроки (3- 4 нед) после инфицирования и могут сохраняться 4 мес (титры АТ до 1:16).

ELISA. В 500 раз чувствительнее PH, менее трудоемок и быстрее выполним. В качестве АГ использовали вирус, концентрированный ПЭГ и очищенный градиентным равновесным ультрацентрифугированием. Оптимальная концентрация АГ составляла 1 мкг на лунку.

Дифференциальная диагностика

При постановке диагноза на ВД-БС необходимо исключить ИРТ, аденовирусную инфекцию, ПГ-3, злокачественную катаральную лихорадку, ящур, паратуберкулезный энтерит и др. Ввиду того, что ВД-БС может проявляться в различных формах (от острой до латентной), часто ассоциируется с такими инфекциями, как ПГ-3, аденоинфекция, хламидиозы и др., для окончательного диагноза необходимы лабораторные исследования. Лишь в качестве подозрения на ВД-БС следует учитывать быстрое распространение в стаде болезни, сопровождающейся лихорадкой, диареей, эрозиями в ротовой полости и ранней лейкопенией.