ЗНАЧЕНИЕ НОВЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Для диагностики вирусных болезней и индикации их возбудителей в окружающей среде интенсивно разрабатываются методы гибридизации нуклеиновых кислот. Важным преимуществом этих методов является возможность выявления их в пробах, в которых вирус уже утратил инфекционность и АГ свойства. Это обусловлено высокой устойчивостью нуклеиновых кислот, особенно двуцепочечных, к жестким физико-химическим воздействиям. Метод ПЦР незаменим также при индикации вирусов, для которых еще не найдены чувствительные культуры клеток и не получены специфические АТ. ПЦР включает в себя три циклически повторяющихся процесса: 1) денатурацию двуцепочечной ДНК путем нагревания реакционной смеси до 95- 100°С; 2) отжиг праймеров (гибридизация праймеров с комплементарными участками одноцепочечной ДНК) и 3) удлинение праймера за счет синтеза новой цепи. Весь цикл длится всего 3-5 мин и может повторяться до 20-40 раз. Теоретически за каждый цикл происходит удвоение количества молекул ДНК в пробе. В таком случае 30 циклов должны завершаться увеличением количества ДНК в миллиард раз.

Первые работы по амплификации нуклеиновых кислот в ПЦР проводили с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы кишечной палочки. В дальнейшем полимераза кишечной палочки была заменена термостабильной ДНК-полимеразой бактерии термус акватикус, устойчивой к нагреванию до 95°С, что привело также к повышению специфичности ПЦР и увеличению выхода продукта реакции.

В 1985г. Кэри Б. Мюллис предложила метод амплификации (amplification - увеличение, усиление) заранее выбранного участва ДНК в пробирке, по существу являющийся методом клонирования in vitro. Метод получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР, от англ. Polymerase Chain Reaction, PCR).

ПНР основана на амплификации ДНК с помощью термостабильной (выделенной из бактерий термофилов, живущих в геотермических источниках) ДНК-полимеразы, осуществляющий синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух олигонуклеотидных праймеров (затравок). Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности которую необходимо амплифицировать. Очевидно, что для амплификации интересующего района ДНК необходимо иметь хотя бы минимальную информацию о его концевых участках (например, об N-C-концевых последовательностей белка, если речь идет об амплификации областей его гена) с тем чтобы синтезировать соответствующие праймеры. При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются в цепь новосинтезирующих молекул ДНК. Каждая из вновь синтезируемых молекул ДНК с помощью одного из праймеров может служить матрицей для синтеза комплементарной ДНК с помощью другого праймера. Для этого надо лишь денатурировать образовавшиеся в результате первой стадии реакции двуцепочечные молекулы ДНК, дать возможность праймерам комплементарно присоединиться к ДНК и осуществить элонгацию.

Практическая сторона ПЦР выглядит достаточно просто и обстоятельно изложена в книге Т.Маниатис и др., «Мир», 1984.

Эффективность метода ПЦР такова, что по прошествие 25-30 циклов для того, чтобы увидеть окрашенный бромистым этидием ДНК-продукт после электрофореза в агарозе, достаточно взять десятую часть реакционной смеси, даже в том случае, если исходное количество нужной ДНК в пробе было исчезающе малым. Интересующий фрагмент ДНК далее может быть использован непосредственно с помощью стандартных методов.

Таким образом, ПЦР состоит и трех основных процедур: подготовки исследуемой пробы материала, которая большинстве случаев сводится к изоляции ДНК или РНК, собственно ПЦР и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК).

В настоящее время ПЦР в сочетании с методом гибридизации НК успешно исползуется для выявления вирусов СПИД, гепатита В, папиллома- вирусов и открывает качественно новые возможности для повышения чувствительности и скорости обнаружения вирусов. Эта реакция может стать особенно полезной при исследовании проб окружающей среды, так как такие пробы очень трудно исследовать с использованием культуры клеток из- за сильной загрязненности их самыми разнообразными микроорганизмами. ПЦР начинает широко применяться в диагностической практике как экспресс-метод диагностики инфекционных болезней, вызываемых ДНК и РНК-содержащими вирионами, автор ПЦР - Кэри Мюллос (США) - удостоена за разработку и внедрение указанного метода Нобелевской премией.

В настоящее время уже четко определены недостатки и трудности, которые встречаются при использовании общепринятой процедуры ПЦР.

В последние годы появилось много модификаций ПЦР, повышающих ее надежность. Так, качество амплификации проверяется рестрикционным анализом. Для проведения количественной ПЦР предложены различные усовершенствования. Разработаны методы, позволяющие производить оценку результатов без процедуры электрофореза, что не только сокращает время процедуры, но и позволяет механизировать или автоматизировать проведение анализов, что важно при массовых обследованиях (Бело- хвостиков А.С. Мол. ген., микробиол. и вир., 1995, 2, :21). Наиболее простой по исполнению можно считать методику с использованием нового флюоресцентного красителя для выявления амплифицировавшейся ДНК- интерколятора УОУО-1 непосредственно в полипропиленовых планшетах на 96 лунок для иммунологических целей.

ДРУГИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

В последнее время были разработаны новые высокочувствительные и быстрые методы диагностики вирусных инфекций: точечный иммунофер- ментный анализ (дот-ИФА) и твердофазный лантанидный иммунофлюорес- центный анализ (ТФ ЛИФА). Метод дот-ИФА базируется на сорбции АГ на мембранном фильтре и его выявлении вирусспецифическими АТ, конъюгированными пероксидазой хрена. Данный метод был успешно применен для детекции HBsAg вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей и АТ к нему. Метод ТФ ЛИФА основан на применении меченых ионами лантани- дов (европия, тербия, самария и празеодима) иммуноглобулинов с использованием специальных приемов регистрации флюоресценции этих ионов. К настоящему времени на основе ТФ ЛИФА за рубежом созданы диагностические тест-системы для выявления НВзА§, рота- и аденовирусов, вирусов гриппа А и В и других вирусов, вызывающих ОРЗ, а также вирусспецифических АТ к вирусам краснухи и иммунодефицита человека, а также инфекциям вирусов гриппа, клещевого энцефалита и венесуэльского энцефаломиелитов лошадей, осповакцины и ряда других вирусных инфекций. Апробация отечественных тест-систем для дот-ИФА и ТФ ЛИФА показали, что эти тест-системы позволяют быстро и надежно выявлять вирусы (через 1,5-2 ч) в жидких пробах (Градабаев В.Н. и др. Вопр. Вир.,1996, 6 :277).