ДИАГНОСТИКА

Вирус БА выделяется в культуре клеток ВНК-21 и ПСГК-30 и идентифицируется в РСК,- ИФ и РРИД. Предложен метод получения высокоактивной специфической сыворотки для; диагностики БА (17,19). Создан полноразмерный ДНК-зонд ВБА, характеризующийся вы-i сокой чувствительностью. Зонд использовали как при проведении реакции молекулярной! гибридизации, так и для повышения чувствительности рестрикционного анализа (74). Раз-*; работай диагностический тест, позволяющий дифференцировать инфицированных и вакци-! нированных gl-вакциной животных. Эта тест-система в совокупности с высокоэффективной! маркированной gl-вакциной может быть использована для разработки программы искоренения БА в хозяйствах и регионах (20). МонАТ можно использовать для обнаружения ВБА в различных материалах.

Работы последних лет (20, 21, 70, 74, 76, 105а, 114) свидетельствуют о возможности разработки и внедрения высокоэффективных экспресс-методов диагностики БА, оценки* эпизоотической ситуации в хозяйстве, регионе, прогнозирования эпизоотического и экологического состояния.

Экспресс-диагностика. Методика получения высокоочищенной ДНК ВБА для диагностики с использованием методов рестрикционного картирования, ПЦР и секвенирования разработана во ВНИИЗЖ (1а1). Можно проводить детекцию ВБА при помощи ПЦР и твердофазной гибридизации в плашках для микротитрования по методу детекции простого герпеса ВПГ-1 и ВПГ-2, поскольку разработан вариант ПЦР, позволяющий проводить одновременную детекцию и генотипирование ВПГ из клинических образцов при использовании меченных флюоресцирующих праймеров, способных амплифицировать полимеразные гены ВПГ-1 и ВПГ-2. При сопоставлении разработанного метода со стандартным культуральным методом индикации вируса показана его 100%-ная чувствительность и 94,2%-ная специфичность (41а).

Выделение вируса

Взятие и подготовка материала. Для выделения ВБА используют головной мозг, кусочки легких, селезенки, печени, лимфоузлов, миндалин, полученные при вскрытии трупов. Миндалины - наилучший материал для выделения вируса (41). При жизни от больных свиней вирус можно выделить из носовых секретов, в которых он появляется на 4-6-й день после болезни и сохраняется в течение 5 -11 ди после выздоровления. Показана возможность выделения ВБА из ганглиев тройничного нерва латентно инфицированных свиней (52). От абортировавших животных используют плоды и плаценту.

При сборе материалов для вирусологического исследования следует помнить о неравно- ?' мерном распределении вируса в разных участках мозга, поэтому, чтобы избежать ошибок. при постановке диагноза, следует брать минимум 2-3 пробы из разных участков мозга, расположенных на некотором расстоянии друг от друга. Обычно при вскрытии отбирают ку- \ сочки мозжечка, продолговатого мозга, больших полушарий головного мозга. В лаборатории материалы обрабатывают обычными методами.

Выделение вируса на лабораторных животных. В качестве лабораторной модели для выделения ВБА обычно используют кроликов массой 2-2,5 кг, которым внутримышечно или подкожно вводят по 1 мл 10%-ной суспензии исследуемого материала. Инкубационный период в этом случае продолжается 36-48 ч, иногда он может длиться 4-6 дн, а в некоторых случаях - даже до 12 дн. Различают энцефалитическую, менингиальную, паралитическую, зудневую и стертую формы болезни. Течение экспериментальной инфекции во многом зависит от способа заражения. Биопробу считают положительной, если кролики погибают с клиническими признаками БА ( нервная форма, зуд, расчесы) через 2-10 дн после инокуляции суспензии из патологического материала. Если кролики погибают без признаков БА, биопробу повторяют, используя патологический материал первого пассажа. Считают, что инокуляция материала в переднюю камеру глаза кролика приводит к характерной зудневой форме болезни. Материалом для выделения вируса от погибших кроликов служат ткани головного и спинного мозга, а также паренхиматозные органы ( легкие, печень). Гибель кроликов после введения материала от свиней или пушных зверей без признаков зуда и расчесов может свидетельствовать о выделении вакцинных штаммов ВБА.

Выделение вируса в культурах клеток. Показано, что культуры клеток так же чувствительны к ВБА, как и кролики, к тому же они могут быть использованы для лабораторной диагностики атипичного течения болезни, при котором опыты по выявлению вируса в мозге свиней путем заражения кроликов дают отрицательные или нетипичные результаты (25). Обычно используют первичнотрипсинизированные культуры клеток почек и щитовидной железы свиней, семенников телят, фибробластов КЭ, перевиваемые клетки РК-15, ВНК-21. К вирусу высокочувствительны субкультуры первого пассажа клеток почки поросенка и КРС.

Метод электронной микроскопии. Позволяет обнаружить ВБА через сутки после экспериментального заражения в мазках-отпечатках, которые готовят непосредственно на ЭМ сеточках со слизистой оболочки глаза, носа, ротовой полости и из мочи.

Серологическая идентификация

Для идентификации ВБА используют в, основном, PH в культуре клеток или на кроликах, ИФ, РДП, РНГА и др. Креме того, для этой цели можно использовать РСК, однако из- за нестандартности АГ и непостоянства результатов самой реакции она не нашла широкого применения.

PH. Удобный и надежный метод индентификации выделенного вируса. Используют культуру клеток того же вида, на которой был изолирован вирус. Реакцию ставят по общепринятой методике, чаще используют вариант: различные разведения вируса (10"1 - 10'7) и постоянную дозу сыворотки. Результаты PH учитывают по ЦПД через 2-5 сут. Вирус считают идентифицированным, если индекс нейтрализации составляет 2 и выше (25).

ИФ. Используют для быстрой индикации и идентификации АГ ВБА в клеточных культурах, инфицированных материалом, содержащим вирус, а также в замороженных срезах ткани мозга кроликов, зараженных суспензией патологического материала, или поросят, заболевших в естественных условиях. Препараты готовят и окрашивают по общепринятой методике. В положительных случаях в срезах мозга обнаруживают специфическую флюоресценцию. В головном мозге поражаются, главным образом, нейроны коры. При малом увеличении можно видеть широкие полоски флюоресцирующих нейронов, в которых заметны только отдельные флюоресцирующие клетки. В срезах мозжечка пораженные клетки распределены более беспорядочно. Часто они видны как флюоресцирующие фокусы в зернистом слое. Иногда в них оказываются вовлеченными единичные клетки Пуркинье, но особого аффинитета вируса к этим клеткам обычно не наблюдают.

Распределение флюоресценции внутри клеток может варьировать в широких пределах. Иногда вирусный АГ обнаруживают как в цитоплазме, так и в ядре, но обычно свечение ядра выражено сильнее. Часто флюоресцирующие массы имеют вид светящейся пыли или мелких гранул. В отдельных случаях удается обнаружить внутриядерные включения типа А Коудри, однако более неправильной формы, чем в препаратах, фиксированных и окрашенных обычными методами. Иногда светится только цитоплазма, причем степень свечения и характер распределения также варьируют. Часто обнаруживают скопление светящихся гранул вокруг ядер. В некоторых районах можно заметить мелкие светящиеся частицы вдоль аксонов. Для выделения вируса инфекционный материал, полученный из мозговой ткани, миндалин и селезенки животных, наносят непосредственно на монослой чувствительных к вирусу клеток и центрифугируют 40-60 мин при 1500& Затем инокулят заменяют питательной средой, а инфицированные клетки инкубируют в термостате в течение 12-14 ч.

Предложен метод диагностики БА посредством обнаружения вируса в срезах головного и спинного мозга, миндалин, легких, селезенки и бронхиальных лимфоузлов. Точный диагноз удается поставить в 75-81% случаев. Специфическую ИФ в мазках-отпечатках слизистой глотки поросят наблюдают с 1-го по 12-й дн после экспериментального заражения вирулентным шт., а в препаратах из мозга на 4-й дн. При отсутствии клинических признаков АГ обнаруживают в мазках из глотки и мозга соответственно на 2-10-й и 2-6-й день.

Вирусный АГ в ИФ выявляют в первичных культурах клеток и КЭ через 18-24 ч после заражения. При исследовании в ИФ отпечатков головного, спинного мозга, легких и селезенки больных животных АГ обнаруживают с 3-4-го дн после заражения. С помощью ИФ специфический АГ в культуре клеток тестикул бычка выявляется в оптимальные сроки после заражения (24-40 ч) в титре 5 - 10 1? ТЦДз0/ 02

РНГА. Антиген ВБА с помощью иммуноглобулинового варианта РНГА и РТНГА можно выявлять за 1-3 дн до появления клинических признаков болезни, в период болезни и после переболевания. При приготовлении эритроцитарного иммуноглобулинового диагности- кума используют гипериммунную сыворотку свиней и крыс с титром ВНА 11,5 и 11,0 1о&, соответственно. Данные реакции имеют преимущества перед PH (25).

РДП. Реакцию с успехом применяют для идентификации вируса, репродуцированного в культуре клеток. Получены обнадеживающие результаты при исследовании полевого материала микрометодом РДП.

РИЭФ. Эго ускоренный метод распозновання АГ. Антиген ВБА в электрополе движется к аноду, АТ - к катоду, и на месте их встречи образуется линия преципитации. Время появления полос зависит от напряжения тока. РИЭФ значительно чувствительнее и протекает в 10-15 раз быстрее, чем обычная РДП.

РСК. Данная реакция не нашла широкого применения, так как положительные результаты получаются при использовании специального метода изготовления АГ. Однако РСК рекомендуется как диагностический метод при индикации ВБА в инфицированных культурах клеток и патологическом материале в условиях биопредприятий, производящих вакцину против этой болезни, и для практических ветеринарных лабораторий (11).

ИФА. Можно быстро идентифицировать вирус прямым ИФА. Антисыворотку к вирусу для мечения ферментом получают на поросятах 6-мес возраста. ИФА по чувствительности равен ИФ и превосходит метод выделения вируса в культуре клеток (25).

При окрашивании прямым иммунопероксидазным методом в мазках-отпечатках обнаруживали клетки, содержащие АГ вируса в виде красно-коричневых гранул в цитоплазме и ядре нейронов мозга и в эпителии слизистой оболочки фаренгиальной области.

Метод рестрикционного анализа и гибридизации. С помощью специфических гибри- дизационных зондов разработана экспресс-диагностика БА у свиней. Предложен метод точечной гибридизации (ДНК-зонда) для выявления вируса в материалах из органов свиней. Чувствительность зондов р ТМ 11 для выявления ДНК ВБА составляла 20 пг вирусной ДНК. Метод дот-блог гибридизации коррелирует с методами выделения вируса из тканей животных, павших при остром течении болезни. Он позволит выявлять геном вируса при латентной инфекции. Гибридизациоиные зонды, основанные на применении рекомбинантной ДНК, позволяют обнаруживать вирусный геном в костном мозге (50%), макрофагах, лимфоцитах и тимусе (20%) зараженных поросят. Предложен метод быстрой диагностики с помощью усовершенствованной гибридизации с использованием биотииилированиых ДНК- зондов на фиксированных формалином парафинированных срезах тканей (27,28).

ВБА может сохраняться в организме переболевших свиней в латентной форме и способен реактивироваться спонтанно или после экзогенной стимуляции. Разработан метод диагностики латентной инфекции. Для этого были сконструированы соответствующие экспрессирующие векторы н получены специфические АГ, которые могут быть использованы в качестве зондов для выявления латентного ВБА в клинических пробах. Выявлены участки ДНК вируса, которые могут быть использованы в качестве проб нуклеиновой кислоты, дифференцирующих монослойную и продуктивную инфекцию. Предложенный метод авторы рекомендуют для диагностики. Приведена физическая карта ДНК ВБА, указана локализация генов групп А и В при латентной инфекции и генов групп С и Д и самого раннего гена при продуктивной инфекции (37).

Обнаружен и изучен домен латентности ВБА методом амплификации в ПЦР. Установлена ответственность сегмента этого домена - гликопротеина ?р50. Если в образцах тканей из различных органов латентно зараженных свиней ВБА не обнаруживался, то с помощью амплификации в ПЦР он был обнаружен в тканях ствола мозга, тригеминальных ганглий и слезных железах почти у всех латентно инфицированных свиней (111).

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. При диагностике ВБА к серологическим данным необходимо относиться осторожно, поскольку не исключено, что часть положительных результатов может быть обусловлена другими ГВ КРС или другими штаммами ВБА с низкой вирулентностью (92). Диагноз на прошедшую инфекцию ставят обычно при помощи PH в культуре клеток, определяя титры ВНА к ВБА в сыворотках крови реконвалесцентов. Для более точной диагностики лучше исследовать парные сыворотки, взятые с интервалом в 3-4 нед. Титры АТ у переболевших животных могут колебаться в широких пределах - от 1:32 до 1:256. У поросят и подсвинков, зараженных ВБА, специфические ВНА появляются к 6-8-му дню после заражения, достигая максимума через 3-4 нед. Через 100 дн после заражения титры ВНА начинают снижаться, а через 135 дн АТ уже обычно не иахо- дят. У естественно больных и переболевших подсвинков ВНА удается установить примерно в те же сроки, хотя в сыворотках переболевших свиней их иногда удается обнаружить в течение 4,5 лет. АТ также находят и у свиней, перенесших бессимптомную инфекцию. Динамика ВНА у животных других видов недостаточно изучена. Характерным является увеличение титра АТ у свиноматок непосредственно перед опоросом: новорожденные поросята получают АТ от матерей. Для обнаружения и титрования АТ, кроме PH, применяют РНГ А, РДП, РСК, ELISA и ряд других реакций.

PH. ставят с постоянной дозой вируса (1000 ТЦД50/0,1 мл) и разньми разведениями сыворотки (от 1:2 до 1:16) по общепринятой методике. Для выявления животных, инфицированных ВБА в естественных условиях, PH более надежна, чем вирусологическое исследование смывов полости рта и глотки. Наибольшей чувствительностью обладает метод постановки PH в культуре клеток Vero со шт. Filaxia.

РНГА. Сообщалось об успешном применении РНГА для выявления специфических антител в молозиве, молоке и сыворотках крови животных. Пробы молока и молозива берут в течение недели после опороса свиноматок н консервируют их 1% р-ром борной кислоты. Сыворотку молока и молознва перед реакцией инактивируют при 56°С 30 мин. Для изготовления эритроцитарного диагностикума наиболее пригоден концентрированный культуральный вирус с титром 8,5 ТЦД50/„„. Некоторые авторы считают, что PH менее чувствительная, чем РНГ А; с помощью PH АТ на ранней стадии болезни не выявлялись, их обнаруживали лишь с 12-го дн, тогда как РНГА - на 5-й дн(24).

ВИЭФ. Рекомендуют для выявления АТ к данному вирусу. АГ для ВИЭФ готовят, выращивая вирус на первичной культуре клеток почек свиней. Результаты ВИЭФ полностью коррелировали с данными PH. Для проведения ВИЭФ были пригодны как нативные, так и инактивированные АГ ВБА в 1%-ной агарозе при напряжении 10 В/см в течение 60 мин. В сыворотках всех больных животных с 7-10-го дня выявляли АТ.

РДП. Для ориентировочных диагностических исследований РДП оказалась вполне пригодной в программе борьбы с БА. Для получения АГ после концентрации и очистки вируса применяют химические детергенты (20%-ный дезоксихалат натрия, 20%-ный тритон X, 1%- ный р-меркаптозтанол) и добиваются АГ фракции такой чувствительности, которая в РДП с сывороткой титра 1:4 дает в 100 и 85-90% случаев четкую положительную реакцию (81, 82). Разработан метод концентрирования вируса Б А с помощью ПЭГ (1а).

EL1SA. Он в 60-100 раз более чувствителен, чем PH. АТ в ELISA обнаруживают на 5-6- й дн после заражения, в PH - на 9-10-й. Иммуноглобулины классов IgG и IgM определяют в ELISA с 5-го дня после инокуляции вируса, причем максимум титров IgM приходился на 9- 10-е сут, a IgG - на 10-15 сут. ELISA вполне может быть использован вместо PH для диагностики болезни при условии наличия соответствующего оборудования и высококачественных диагностических наборов. С помощью данного теста можно проводить регулярные обследования больших групп животных. Для определения у свиней АТ к ВБА рекомендуется использовать микрометод. АГ готовят из культуры клеток РК-15, зараженной полевым штаммом вируса. Через 48 ч инкубирования зараженные клетки культуры разрушают замораживанием, оттаиванием и дополнительно ультразвуком, а затем концентрируют в 30 раз ультрацентрифугированием. АГ в трисбуфере pH 9,6 адсорбируют в течение ночи при 4°С в луночках микропанели. После этого луночки промывают, вносят пробы испытуемых сывороток в разведении 1:160 в твин-20-фосфатно-буферном р-ре и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. Фиксацию АТ на АГ определяют добавлением антисвиных кроличьих глобулинов, меченных пероксидазой, разведенной в твин-20-фосфатном буферном р-ре 1:10000. Количество связанной пероксид азы определяют в реакции с ортофенилендиамином в присутствии перекиси водорода в цитрат-фосфатном буфере с pH 5 при комнатной температуре. Реакцию прекращают через 15 мин добавлением 50 мкл NH2S 04. ELISA оказался более чувствительным, быстро выполнимым производительным тестом, чем PH в культуре клеток. После УФ облучения луночки с иммуносорбентом хранить при 4°С длительное время.

Разработан и применяется в странах Европы метод быстрой ретроспективной диагностики БА с помощью MAC-ELISA, основанного на захвате специфических к вирусу IgM АТ мышиными монАТ против IgM свиньи, и используя антивирусный кроличий гиперим- мунный у-глобулин в качестве индикатора (77).

В ФРГ имеются национальные стандарты для оценки сывороток свиней при БА (97). Для упрощения определения АТ к ВБ А предложено использовать бумажные фильтры, которые пропитывают испытуемым образцом крови, высушивают и хранят до проведения индикации. Последняя проводится стандартным иммуноферментным методом. Специфичность данного метода составляет 100%, чувствительность - 90-96%.

РРИД. АТ к ВБА могут быть определены в течение одной ночи в реакции радиальной иммунодиффузии. Титры АТ определяют визуально по окрашенным круговым зонам, диаметр которых (в мм) пересчитывается на соответствующие значения титров. Описана техника исполнения теста (46).

Латексагглютинация. Для ускоренной серологической диагностики предложен метод агглютинации частиц латекса, покрытых антигеном ВБА. Наличие в исследуемой сыворотке специфических АТ вызывает агглютинацию частиц, регистрируемую визуально. Реакция с латексом отличается высокой чувствительностью. Ее применение особенно эффективно в ранних фазах инфекции, когда в сыворотке больных животных содержится значительное количество IgM с высокой агглютинирующей активностью.

РИА. Для определения специфичных сывороточных АТ превосходит по чувствительности PH и широко применяется в виде непрямого твердофазного микрорадиоиммунологиче- ского теста. Обладая высокой чувствительностью, он не зависит от культуры клеток и является быстрым, точным и пригодным для массовых анализов. С использованием монАТ разработаны модифицированные реакции радиальной иммунодиффузии ферментного и микро- иммуноферментного определения АТ к данному вирусу. Оба вируса пригодны для проведения сероэпизоотологического обследования на БА в полевых условиях. Предложен новый метод определения АТ к ВБА в сыворотках свиней с помощью непрямого иммуноперокси- дазного окрашивания бляшек. По чувствительности, специфичности он превышает ИФА.

Аллергическая проба. Разработан кожный аллергический метод диагностики БА. Он позволяет в короткий срок ставить диагноз непосредственно в хозяйствах. Метод основан на феномене гиперчувствительности замедленного типа у латентно больных животных. При введении убитого нагреванием АГ в нижнее веко, внутреннюю и дорсолатеральную часть грудной клетки, а у поросят в медиальную поверхность бедра, реакция наблюдается через 24-48 ч и выражается образованием отечной припухлости тестоватой консистенции от 2 до 4 см в диаметре с покраснением в центре (место введения АГ). Чувствительность реакции достаточно высокая: 72% переболевших животных реагируют положительно. Из числа переболевших без клинических признаков реагируют положительно 47% животных. Реакция проявляется в более поздней стадии болезни, которая сохраняется после прекращения эпизоотии. Ее можно использовать для выявления стационарных очагов инфекции. Высокий титр ВНА и процент положительных кожноаллергических реакций обнаруживали у переболевших животных через 14 и 30 дн после заражения. Аллергическая проба позволяет выявлять инфицированных животных с 7-го по 20-й дн болезни.

Дифференциальная диагностика

Б А следует дифференцировать у свиней от болезни Тешена, чумы, бешенства, гриппа, сальмонеллеза, отечной болезни, листериоза, дипло, стрептококкоза, гипогликемии, солевого отравления, аскаридоза, авитаминоза; у крупного и мелкого рогатого скота - от бешенства, листериоза, кормового отравления, ценуроза; у лошадей - от менингоэнцефалита, бешенства, отравления; у пушных зверей - от чумы и энцефаломиелита лисиц; у собак - от бешенства, чумы плотоядных; у кошек - от бешенства.

Д ля дифференциации от бешенства проводят биопробу на мышатах и ИФ, а также микроскопию для выявления телец Бабеша - Негри. Для исключения чумы, болезни Тешена ставят биопробу на кроликах, гриппа свиней - проводят биопробу и исследуют выделенный вирус в РГА, РТГА. Листериоз, сальмонеллез, отечную болезнь и другие бактериальные инфекции исключают бактериологическим исследованием, отравления - по данным лабораторного химического анализа и биопробы. Существует схема дифференциальной диагностики Б А по Петте и Манелю с использованием культуры клеток.