ДИАГНОСТИКА

42, 45).

Выделение вируса Успех выделения вируса из патологического материала в большой степени зависит от правильности сбора и хранения подлежащих исследованию проб. Выделение РСВ затруднено ввиду его чрезвычайной лабильности. Выделить его от больных животных возможно только на ранней стадии инфекции и вероятность выделения снижается с появлением признаков заболевания. У телят вирус выделяли из носоглотки на 2-11-й день после заражения. Важно отметить, что РСВ, в основном, выявляют в выделениях и тканях дыхательных путей. Лучшие результаты получают, проводя заражение культур клеток как можно скорее после взятия материала и до исследования, избегая его замораживания. Однако выделение вполне возможно и из материала, хранившегося 3-5 ч при 4°С или быстрозамороженного и помещенного для хранения при -70°С.

Заражение культур клеток. Для выделения РСВ КРС используют прием сокультиви- рования клеток периферической крови или лимфоидных органов с чувствительными к репликации РСВ клетками эмбриона КРС. Обычно выделение вируса проводят в первично- трипсинизированных культурах клеток эмбриона КРС (ПЭК, ЛЭК, ТБ). Культуры клеток овечьего происхождения (FLK, почки и семенники ягнят) обладают большей чувствительностью к РСВ КРС, и титр вируса достигает больших величин, чем в культурах клеток телят (до 105 БОЕ/мл); в синцитиях наблюдали от 10 до 40 ядер.

Идентификация вируса

Обнаружение специфических телец-включений. У экспериментально зараженных телят наблюдают резкие изменения в бронхах, бронхиолах и альвеолах, характеризующиеся появлением много ядерных эпителиальных клеток, многие из которых на 4-6-й день после заражения содержали эозинофильные тельца-включения. В зараженных культурах ПЭК, ЛЭК, ТБ, окрашенных по Селлерсу, Май-Грюнвальду, Гимза или гематоксилин-эозином, фокусы ЦПД состоят из синцитиальных клеток различного размера. Такие клетки содержат гомогенные ацидофильные цитоплазматические включения различного размера и формы. Поскольку эти включения не окрашиваются акридиновым оранжевым, то они представляются оптически пустыми на фоне красной цитоплазмы.

ИФ. Идентификацию выделенного вируса проводят в ИФ, она чувствительна и точна. Постановка её аналогична таковой при диагностике аденовирусной инфекции. ИФ клеток респираторного тракта КРС выявляется в виде полиморфных флюоресцирующих включений в цитоплазме или свечения всего цитоплазматического поля клетки. Для исследования в ИФ готовят мазки со слизистой оболочки носа, трахеи, а также препараты-отпечатки легких и лимфоузлов. Цитологический материал, используемый для ИФ, должен быть свежим, замораживание его резко снижает качество флюоресценции. Методом ИФ вирус обнаруживали в клетках бронхиального эпителия и альвеолярного экссудата в течение 11 лет. После заражения эпителиальные клетки легких, очевидно, являются клетками-мишенямн для вируса, индуцирующего образование эпителиально-клеточного синцития во многих участках легких (22, 68, 71, 72).

В ИФ можно использовать не только зараженные культуры клеток на покровных стеклах, но и мазки, приготовленные из клеток зараженной пробирочной культуры.

РДП. РДП часто используют для идентификации вируса», выделенного в культуре клеток. Методика постановки, приготовления АГ и учета результатов реакции аналогична таковой при диагностике аденовирусной инфекции.

PH. В ветеринарной диагностической практике PH применяется редко. Существуют штаммы, которые значительно хуже нейтрализуются иммунной сывороткой к прототипному штамму (например, шт. Long), чем гомологичной иммунной сывороткой. В подобном случае или при очень высоком титре исследуемого штамма синцитиальные клетки могут появиться и в пробирках с иммунной сывороткой. Однако в этом случае наблюдается значительно более позднее их появление по сравнению с контрольными пробирками (41, 74).

ИФА. Предложен для определения АГ РСВ в парафиновых срезах легких телят, естественно больных пневмонией. Специфическое окрашивание иммунопероксидазным конъюгатом регистрируют в цитоплазме эпителиальных клеток, в синцитии малых бронхов, бронхиол и альвеол. Метод пригоден и для ретроспективной диагностики РСВ при исследовании парафиновых блоков, хранящихся в течение нескольких лет.

В качестве экспресс-диагностики предложен метод обнаружения РСВ путем точечной гибридизации с применением нерадиоактивного синтетического олигодезоксирибонуклео- тидного зонда (38). Такие зонды дифференцируют подгруппы РСВ в реакции гибридизации нуклеиновых кислот. Кроме того, предложен быстрый метод диагностики РСВ с помощью коммерческих тест-тампонов Pernasal. Последующий скрининг мазков в покровных стеклах с мечеными АТ к РСВ показал, что данная процедура упрощает и ускоряет диагностику респираторных вирусных инфекций (54). Обнаружение РСВ в секретах носоглотки можно проводить одним из двух методов: либо методом гибридизации in situ с применением меченых биотином алигонуклеотидных зондов на геномную РСВ, либо меченым флюоресцеином. Иммунологический метод оказался более быстрым и эффективным (21). Возможно быстрое обнаружение РСВ в носоглоточных смывах с помощью обратной транскрипции и амплификации в ПЦР ( 616 ).

Серологическая и ретроспективная диагностика. Основана на выявлении АТ в сыворотке крови больных и переболевших животных в РДП, непрямой РИФ, РСК, PH и других реакциях. Для этой цели необходимо иметь высокоактивный эталонный РСВ. Испытуемые сыворотки прогревают при 56°С 30 мин. При РСБ, протекающей в естественных условиях, отмечали нарастание титра АТ у животных в первые 10 дн болезни. ВНА были выявлены с 8-14-й дн у телят, свободных от материнских АТ. Отмечена линейная корреляция между титрами АТ, выявляемых в РСК и PH.

PH проводят в культуре клеток. Титр эталонного РСВ должен быть не ниже 105 ТЦД50/МЛ . Для этого его пассируют до такого уровня, когда дегенерация 100% клеток наступает в течение 4 дн. При PH используют различные разведения сыворотки и постоянную дозу вируса 103 ТЦД50/МЛ. Смесь сыворотки с вирусом выдерживают 2 ч при комнатной температуре, затем вносят по 0,2 мл в культуру клеток и инкубируют. Начиная с 4-го дня после заражения ежедневно проверяют пробирки с “контролем вируса”. При признаках дегенерации у 75-100% клеток (обычно на 5-6-й дн) учитывают результаты всего опыта. Обычно в пробирках с сывороткой в интервале 3-5 последовательных разведений наблюдается отчетливое, но не полное подавление активности вируса, поэтому для оценки титра критерий полной нейтрализации вируса не используют.

Титром сыворотки считают разведение, подавляющее развитие синцития на основной площади клеточного слоя при возможном возникновении маленьких очагов синцития или округлении клеток не более чем на один плюс (25% клеток культуры, в которой обнаруживается дегенерация). Конечный результат, который учитывают в пробирках одного разведения сыворотки, является средней величиной результатов, зарегистрированных в каждой из пробирок. При добавлении к культуре нейтрального красного в конечной концентрации 1:80000 синцитий в течение 1 ч при 36 °С окрашивается в красный цвет, что может помочь при оценке результатов. Повышению чувствительности PH способствует использование сывороток, не подвергавшихся нагреванию.

Более чувствительной и точной пробой для обнаружения и оценки уровня АТ является реакция подавления бляшкообразования. На клетках с покрытием из метилцеллюлозы синцитиальные бляшки образуются в течение 4 дн. Бляшки легко обнаруживают и подсчитывают в культурах, окрашенных по Гимзе, под стереоскопическим микроскопом. Оценку нейтрализующей активности сыворотки можно провести по снижению титра бляшкобразования или разведению сыворотки, подавляющей образование 50% бляшек.

Метод непрямой ИФ применяют для выявления специфических IgM к РСВ. Предложен сухой эритроцитарный диагностикум РСБ. Положительные результаты в РНГА составляли 72,2%, в PH - 69 и в РСК - 55,2 %.

При сравнительной оценке эффективности различных методов было установлено, что титры АТ в ИФА и РСК были сопоставимы. В PH в большем проценте АТ выявлялись в острой фазе болезни и в меньшем- ELISA, что зависело от эффективности конъюгата при обнаружении ранних IgM. Однако PH была менее эффективна при постановке диагноза на основании увеличения титров АТ в парных сыворотках, поскольку в полевых условиях некоторые животные могут быть исследованы относительно поздно и уловить нарастание титров трудно. В качестве диагностического теста при РСБ КРС более эффективен ELISA как наиболее чувствительный, требующий меиьших затрат труда, независящий от наличия чувствительной культуры клеток по сравнению с PH и РСК. Некоторые исследователи пришли к выводу, что наиболее чувствительной реакцией для серодиагностики острой РСБ является нарастание титра IgG при использовании ELISA (3). ELISA широко применяются в Швейцарии (30). РНГА используется для ретроспективной диагностики РСБ КРС. Этот простой высокоспецифичный метод более перспективен, чем PH.

Дифференциальная диагностика. По данным эпизоотологического анализа, клиническим и патологоанатомическим признакам поставить диагноз очень трудно ввиду сходства РСБ со многими патологоанатомическими явлениями различной этиологии (ПГ-3, ВД-БС, ИРТ, хламидиоз и т. д.). Поэтому основу диагностики составляют лабораторные методы, а клинические показатели помогают ускорить постановку диагноза.

ИММУНИТЕТ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

Иммунитет при РСБ не изучен. В нашей стране вакцины против этой инфекции нет. Инфекция у телят в возрасте 1-3 мес на фоне материнских АТ не стимулирует образование гуморальных АТ, хотя в слизистой оболочке дыхательных путей появляются IgA. Инфицирование таких телят сопровождается появлением в респираторном тракте противовирусных IgM, IgA, IgG. Ускоренная их продукция отмечается при повторном заражении. На поверхности эпителиальных клеток верхних дыхательных путей при РСБ идентифицированы АТ всех 3-х типов, но преимущественно IgA (46). Нижние отделы респираторного тракта содержат большее количество IgG, чем носоглоточная область (2). Секреторные АТ отличаются от сывороточных меньшей специфичностью, поскольку они способны нейтрализовать инфекционную активность гетерогенных штаммов в пределах подтипа (65 а). Однако не выявлено корреляции между уровнем вирусспецифических IgA и приживляемостью вируса в носоглотке. Потенциальное значение специфических антител в защите легких от РСБ продемонстрировано в опытах на мышах (34). При реинфекции они способствуют более выраженной иммунной реакции. Подавление материнскими АТ формирования сывороточных и секреторных АТ затрудняет создание вакцины против РСБ. Наибольшей иммуногенностью и протективностью из 10 белковых АГ РСВ обладает белок слияния - гликопротеин А за которым идет белок G (46). В защите от РСБ важную роль играют клеточные механизмы, опосредованные специфическими АТ и инфицированные вирусом. Моноциты лизируются свежими лимфоцитами этого же животного в присутствии иммунной сыворотки. Только РСВ и рекомбинантный вирусвакцины, экспрессирующий белок F РСВ, индуцирует образование вирусспецифических Т-лимфоцитов у мышей. Инактивированный РСВ или его гликопротеины F и G таким действием не обладают (60,73, 78).

Главным АГ - мишенью для Т-лимфоцитов является F-белок и в меньшей степени белок G РСВ (46, 60). Поэтому разрабатываемые вакцины для надежной защиты должны индуцировать у привитых животных формирование Т-клеточного иммунитета. Нуклеопротеид РСВ распознается лучше Т-клетками-эффекторами, чем поверхностный G гликопротеин. При РСБ имеет место АТ зависимая клеточная цитотоксичность, в которой основной мишенью является А белок вируса, экспрессируемый на поверхности инфицированных клеток. Эта иммунологическая реакция играет важную роль в защите организма и его выздоровлении от РСБ (7). В настоящее время клеточный иммунитет - предмет пристального изучения РСБ; разрабатываемые вакцины должны индуцировать у привитых животных формирование Т- клеточного иммунитета. Одним из перспективных направлений в вакцинной профилактике РСБ является создание субъединичной вакцины, содержащей один или оба вирусных гликопротеина. Весьма перспективным считают получение рекомбинантов вируса осповакцины для профилактики РСБ. В Нидерландах применяют живую вакцину из шт. Rispoval - она иммуногенна и безвредна. Разработана также живая комбинированная вакцина Rispoval - RS-BVD против РСБ и ВД-БС КРС. Вакцина безвредна в полевых условиях и сообщает надежный иммунитет против этих инфекций. Во Франции применяют живую вакцину из шт. КВ94. В ФРГ предложена вакцина из аттенуированного штамма. В Бельгии аттенуированный штамм РСВ был получен путем проведения 94 пассажей в культуре клеток эмбриона КРС (27, 28,31,35). На живую вакцину из шт. RS-52 у привитых телят через месяц образовывались ВНА, сохранявшиеся до 6 мес у 70-90% животных (32, 47). Инактивированную вакцину против РСБ КРС удалось приготовить из инфицированных вирусом клеток, обработанных глютаральдегидом. Продуцентом АГ РСВ являлась персистентно инфицированная культура эпителиальных клеток слизистой оболочки носа КРС. Эта вакцина оказалась более иммуногенной, чем живая из аттенуированного штамма РСВ КРС и TS-мутанта РСВ человека (65).

Серологическая оценка поствакцинального иммунитета. ВНА у привитых живой вакциной животных появляются на 5-й день и сохраняются после ревакцинации до 5 мес. Наличие АТ почти не препятствует возникновению болезни. Видимо, велика роль местного иммунитета. Высокие титры ВНА (1:640) свидетельствовали о тяжести болезни. АТ к РСВ, полученные от матерей, не предохраняют телят от инфекции.