ДИАГНОСТИКА

Выделение вируса. Его изолируют в культуре клеток почек и щитовидной железы свиней. ПВСв выделяют из висцеральных органов больных поросят, глотки, носа, головного мозга, сыворотки крови, кожных поражений. С помощью ИФА парвовирусный АГ выявляют во внешних слоях волосяных фолликулов в коже, прилегающей к поражениям края венчика. Однако, выделение ПВСв считается менее пригодным и надёжным диагностическим тестом, чем РИФ и РГА для выявления вирусного АГ. Во-первых, выделить вирус из погибших или мумифицированных плодов удаётся далеко не всегда, во-вторых, из-за устойчивости ПВСв существует постоянная угроза лабораторного заражения исследуемого материала и клеточных культур. Кроме того, первичные культуры, используемые для выделения вируса, могут быть приготовлены из тканей плодов и поросят, инфицированных ПВСв. Ткани почек поросят чаще контаминированы ПВСв, чем ткани почек плодов. ПВСв обнаружен в культурах клеток, приготовленных из почек 2-3-нед. поросят и плодов, соответственно в 12,5 и 3% случаев. Поэтому при диагностике парвовирусной инфекции свиней используют МФА, РГ А для обнаружения вирусного АГ в тканях плодов и РТГ А, РДП, PH и ELISA для выявления и титрования АТ в сыворотке крови свиноматок, а также в сыворотке мертворождённых плодов и новорождённых поросят до приёма молозива.

Взятие и подготовка материала. На исследование должны быть направлены мумифицированные плоды длиной менее 16 см или лёгкие таких плодов.

Выделение вируса в культуре клеток. Считается менее удобным и надёжным диагностическим тестом из-за вышеуказанных причин. При необходимости для этой цели наиболее часто используют первичные культуры клеток почки эмбриона свиньи, клетки щитовидной железы свиней, перевиваемую культуру клеток тестикул свиньи и почки поросёнка. Культуры клеток, используемые для выделения вируса, предварительно исследуют на контаминацию им. Культуру клеток заражают в период посева или некоторое время спустя, когда они ещё находятся в стадии логарифмического роста. Индикацию вируса клеток проводят по ЦПД, но чаще в ИФ, РГА или по выявлению внутриядерных телец-вкшочений при окраске инфицированных клеток гематоксилин-эозином или титрованием методом бляшек (29, 58). При низкой множественности заражения ЦПД не проявляется и для обнаружения вируса необходимо субкультивирование инфицированных клеток. При культивировании вируса обычно используют сывороточные среды (до 7-10% сыворотки).

ЭМ и ИЭМ. Они более чувствительны, чем ИФ, РГА и выделение вируса.

Обнаружение специфических телец-включений. При окраске инфицированных культур клеток почки поросят гематоксилин-эозином выявляют внутриядерные тельца- включения типа А, которые состоят из вирусного АГ.

Индикация с помощью гибридизационного зонда. В настоящее время осуществимо после картирования ДНК ПВСв.

Серологическая идентификация

ИФ. Надежный и чувствительный диагностический тест идентификации вирусного АГ. При отсутствии у плодов антител АГ выявляется во всех тканях, а в присутствии АТ - главным образом в клетках легкого плода. Этот же метод используют и для идентификации вируса в инфицированных культурах клеток.

РГА. Используется для обнаружения вирусного АГ в тканях плода, для чего из внутренних органов абортированных плодов (длиной менее 16 см) готовят 20-30%-ную суспензию, осветляют центрифугированием при 1000 мин1 20 мин; надосадочную жидкость исследуют в РГА с эритроцитами морской свинки (0,6%-ная взвесь на фосфатном буфере).

Для индикации вируса в культуре клеток в РГА используют культуральную вируссодержащую суспензию. Так как ПС тесио связан с клетками, для освобождения вируса клетки разрушают тремя циклами замораживания при -20°С и быстрого оттаивания при 37°С. РГА ставят общепринятым методом при 4°С . В первичной культуре клеток почки эмбриона свиньи вирус накапливается в титре 108 ТЦД 50/мл и имеет ГА активность 512 ед./0,5 мл и на 1- 2

порядка ниже в культуре клеток. О разработке и внедрении вариантной идентификации вируса с помощью монАТ данных пока нет.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика

РТГА. Наиболее широко применяется для обнаружения специфических АТ в сыворотке крови свиноматок и плодов. С успехом может быть использована для широкого эпизоотоло- гического обследования хозяйств. В ВИЭВ и ВГНКИ ветпрепаратов разработан диагностический набор. Ставят РТГА по общепринятой методике в макро- и микровариантах. Перед постановкой реакции сыворотки крови освобождают от термолабильных и термостабильных ингибиторов гемагглютинации и неспецифических гемагглютининов. От термолабильных ингибиторов сыворотки освобождают прогреванием в водяной бане при 56°С 30 мин, от термостабильных - обработкой каолином. К 0,2 мл инактивированной сыворотки добавляют 0,

6 мл 25%-ной суспензии каолина.

Диагноз считают установленным, если в двух и более пробах сывороток крови свиноматок будут обнаружены специфические АТ в разведении 1:64 и выше. Выявление в РТГА антител в сыворотке крови плодов после 70-го дня супоросности и новорожденных поросят до приема молозива свидетельствует о заражении их в матке, поскольку АТ не проходят через плаценту. У мертворожденных поросят для обнаружения антител используют транссудат из грудной и брюшной полостей.

Обработка сывороток крови 2 М 2-меркаптоэтанолом приводит к разрушению IgM и не влияет на IgG. Разрушенные IgM не выявляются в РТГА. Снижение титра АТ в сыворотке крови в 16 раз и более после обработки их 2-меркаптоэтанолом свидетельствует о том, что после заражения животного парвовирусом прошло не более 20-40 дн.

РГ А используют для выявления антигена ПВСв, а РТГ А - антигена и антител. Установлены хорошее совпадение результатов РТГА и РДП и корреляция между титрами ПА и анти-ГА. РДП в отличие от РТГА не требует специальной обработки испытуемых сывороток для удаления термолабильных и термостабильных ингибиторов гемагглютинации и неспецифических гемагглютининов, однако для ее постановки необходим концентрированный антиген ПВСв. В качестве АГ для РТГ А обьино используют вируссодержащую культуральную жидкость.

PH. Считается более чувствительной, чем РТГ А. Разработана реакция микроиейтрали- зации в пластиковых панелях с круглодонными лунками. В лунки вносят по 0,2 мл суспензии перевиваемых клеток почки свиньи в ростовой среде, содержащей 1-2105 клеток/мл. Лунки герметично закрывают липкой лентой и панели инкубируют 18-24 ч при 37°С. Исследуемую инактивированную сыворотку разводят серийно поддерживающей средой и вносят в нее равный объем (50-100 ТЦД $о/0,2 мл). Смесь вируса с сывороткой инкубируют при 37° С 2 ч. Из ячеек с культурой клеток удаляют ростовую среду и вносят по 0,2 мл смеси вирус-сыворотка. Одну и ту же сыворотку проверяют в 3-4 повторностях. Лунки закрывают липкой клейкой лентой и инкубируют при 37°С 7 дн. Вначале ставят ориентировочную реакцию на нейтрализацию вируса с одним серийным разведением каждой сыворотки путем добавления в каждую лунку по одной капле 0,6%-ной суспензии отмытых эритроцитов морской свинки. Если в лунках с самыми низкими разведениями сывороток гемагглютинация не произошла, значит, в них имелись ВНА и не содержалось естественных ГА. В этом случае остальные серийные разведения тех же сывороток тестируют аналогичным способом. Если в низких разведениях сывороток имелась гемагглютинация, то остальные повторы серийных разведений тестируют так: из лунок удаляют питательную среду, клетки обрабатывают глициновым буфером 30 мин, получаемый экстракт испытывают на ГА активность. Результаты РГА учитывают через 2 ч после добавления эритроцитов. ВНА аналогично выявляют пробирочным методом. Оба метода высокочувствительны и воспроизводимы.

РДП. Простой, высокоспецифичный и достаточно чувствительный метод для обнаружения и количественной оценки АТ к ПС. Сравнительное изучение диагностической ценности РДП и РТГА показало хорошее совпадение результатов этих двух методов, хотя титры АТ в РДП были значительно ниже. Использовали 0,7%-ный агаровый гель на боратном буфере (pH 8,6), содержащем 7% NaCl, 0,9% борной кислоты и 0,2% NaOH. В качестве АГ применяли концентрированную вируссодержащую жидкость с Г А-активностью в разведении не ниже 1:15 000.

Гипериммунные сыворотки к вирусу получают на 6-мес ремонтных свинках, которым вводят концентрированный препарат вируса внутримышечно в смеси с равным количеством полного адъюванта Фрейнда в дозе 3 мл. Через 30 дн вирус вводят повторно без адъюванта, н через 7 дн животных обескровливают. Полученная сыворотка обьино имеет титр преци- питирующих АТ 1:1024 (титр в РТГА 1:16384).

ИФ, ВИЭФ и РСК используются значительно реже, чем РТГ А. Для постановки РСК, как и РДП, необходим концентрированный антиген ПВСв. РСК менее чувствительна, чем РТГА, и выявляет АТ в половине сывороток, имеющих титр АТ в РТГА от 1:40 до 1:1280. Все сыворотки с титром АТ в РТГА 1:2560 и выше положительны в РСК, однако титр КСА составляет только 1:80-1:160.

Обнаружение АТ к ПВСв в жидкости грудной полости абортированных плодов с помощью РТГ А, ИФ и ВИЭФ показало, что ИФ является наиболее чувствительным тестом, а непрямая ИФ для обнаружения АТ в плодных водах оказалась наиболее чувствительной. Для определения серологического статуса в отношении парвовирусной инфекции свиней рекомендуется исследовать в РТГ А сыворотки крови или фолликулярную жидкость яичников, получаемых при убое свиноматок на мясокомбинатах, что исключает необходимость получения проб крови перед убоем. Титры АТ в сыворотке крови и фолликулярной жидкости яичников различались более чем на 1-2-кратное разведение. Основную роль в защите против ПВИСв играет гуморальный иммунитет, и для полной защиты требуется довольно высокий уровень АТ (3). При инактивации ПС формальдегидом Г А активность практически исчезает, тогда как при инактивации ДЭИ снижается незначительно. Однако, по антигенно- сти препараты в обоих случаях практически не различались между собой. Поскольку ПВСв могут передаваться спермой и вызывать у свиноматок нарушение репродуктивной функции, на станциях искусственного осеменения хряков подвергают исследованию в РТГА (52).

ИФА. При выявлении АТ к ПВСв обладает более высокой чувствительностью, чем в РТГА. Титры АТ были в 50-100 раз выше, чем в РТГА, при этом отмечалась корреляция результатов обеих реакций (27, 56).