Методы определения гербицидов

Остатки гербицидов в объектах окружающей среды могут находиться в крайне незначительных концентрациях, измеряемых в пределах 10"6-10'9г/г образца [Спиридонов и др., 2004]. Поэтому для определения содержания гербицидов необходимо использование высокочувствительных методов.

В настоящее время определение гербицидов возможно с применением методов колориметрии, спектрофотометрии, электрохимических методов, различных видов хроматографии, масс-спектрометрии и иммунофер- ментного анализа. Наибольшее распространение получили хроматографические методы.
Хроматографические методы разделения гербицидов
Хроматография - это метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различии в скоростях их перемещения в системе несмеши- вающихся и движущихся относительно друг друга фаз. Поэтому все хроматографические методы основаны на различном поведении аналита в подвижной и неподвижной фазе (сорбент) хроматографической системы, что позволяет проводить разделение компонентов смеси, получаемых в ходе экстракции гербицида. Хроматографические методы достаточно универсальны, специфичны и высокочувствительны, что сделало их наиболее распространенными методами, применяемыми при определении гербицидов.
В зависимости от типа подвижной фазы выделяют два основных типа хроматографии: газовую (подвижная фаза — газ) и жидкостную (подвижная фаза - жидкость). При этом разделение можно проводить в цилиндрическом слое сорбента (колоночная хроматография), в слое сорбента на плоской поверхности (планарная хроматография), в пленке жидкости или слое сорбента, размещенном на внутренней стенке колонки (капиллярная хроматография) или в полях сил: электрических, магнитных и т.д. (хроматография в полях сил) [Спиридонов и др., 2004]. Как в газовой, так и в жидкостной хроматографии разделяющая способность системы может быть повышена с помощью уменьшения размера частиц сорбента или перехода к капиллярным вариантам хроматографии, где путь диффузии разделяемых молекул внутри каждой из двух фаз хроматографической системы сокращен до минимума, а поверхность раздела фаз максимально увеличена.
При поступлении образца в хроматографическую систему компонентам образца, которые сильно связываются неподвижной фазой, требуется большее время для прохождения колонки, чем компонентам, которые остаются преимущественно в подвижной фазе. Поэтому каждый компонент образца можно охарактеризовать характерным для него временем удерживания tr (от англ, retention time) в хроматографической системе. Показатель tr зависит от химической природы вещества и характеризует его взаимодействие с неподвижной фазой. После разделения анализируемой пробы в хроматографической системе происходит детекция, т.е. определение количества вещества в анализируемой пробе. Расчет количества вещества в пробе проводится на основании высоты пика hr, соответствующего tr определяемого вещества, или площади этого пика Sr.
Газовая хроматография (ГХ) применяется для летучих органических веществ, характеризующихся средней или низкой полярностью и термической стойкостью. Подвижная фаза - газ, неподвижная - жидкость на твердом веществе (газо-жидкостная распределительная хроматография) или твердое вещество (газо-твердая адсорбционная хроматография). Подвижная фаза обыкновенно представляет собой инертный газ, такой как гелий, аргон или азот. Так как анализируемые компоненты должны находиться в газообразном состоянии, то температура инжектора должна превышать температуру точки кипения наименее летучего компонента в анализируемой смеси. В настоящее время большинство колонок для ГХ содержат жидкую стационарную фазу на твердом носителе, поэтому такой вариант получил название газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ). Примерами гербицидов, для которых разработаны методы их определения с помощью ГХ, являются бентазон, атразин, метрибузин, алахлор, ацетохлор, метолахлор, напропамид и др.
Жидкостная хроматография (ЖХ) - это аналитический метод, применяемый для разделения ионов или молекул в растворе. Простейшая система жидкостной хроматографии состоит из колонки с неподвижной фазой, уравновешенной с растворителем. Типичными неподвижными фазами являются: твердая (адсорбционная хроматография), ионообменные смолы (ионообменная хроматография), жидкости на инертной твердой подложке (распределительная хроматография), пористые инертные наполнители (гель-проникающая, или эксклюзионная хроматография).
Одной из наиболее распространенных разновидностей жидкостной хроматографии является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3- 5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин). В настоящее время с помощью ВЭЖХ можно определять практически все гербициды и их метаболиты.
Промежуточное положение между жидкостной и газовой хроматографией занимает сверхкритическая флюидная хроматография. В этом методе коэффициенты диффузии сорбата в диоксиде углерода в сверхкритическом состоянии (давление выше 72,9 атм. и температура выше 31,1°С) близки к высоким значениям коэффициентов диффузии в газах, а растворяющая способность флюида СОг, особенно в присутствии добавок метанола, примерно такая же, как у органических жидкостей. Сверхкритическая флюидная хроматография обеспечивает высокоэффективное разделение смесей многих веществ, вплоть до олигомерных молекул. Выгодным отличием этого метода с точки зрения безопасности для окружающей среды является использование в качестве элюента диоксида углерода. Примерами гербицидов, для которых разработаны методы их определения с помощью сверхкритической флюидной хроматографии, являются молинат и тиобенкарб, [Yarita, 2008], а также сульфонилмоче- вины [McNally, Wheeler, 1988]
Основные типы детекторов, используемые при определении гербицидов хроматографическими методами
Заключительным этапом определения вещества является их детектирование. Детектор является преобразователем концентрации анализируемого вещества, растворенного в подвижной фазе, в электрический сигнал.
Для детектирования компонентов пробы может быть использовано любое физико-химическое свойство подвижной фазы (поглощение света, излучение света, электропроводность, показатель преломления и т.д.), которое изменяется при наличии в ней молекул разделяемых соединений [Орлов, Аратсков, 1997]. Основные типы детекторов, используемых для определения гербицидов после их хроматографического разделения, приведены в табл. 17.

Детектор	Причина	Что измеряется Определяемые гер-
	ионизации		бициды
Пламенно ионизационный	Пламя	Сила тока	Все
ПИД-термоионный	Пламя	Сила тока	Р, N, галогены
Электронного захвата	Радиация	Сила тока	Галогены, S, нитрилы
Фотоионизационный	УФ	Проводимость	Все
Элетролитической проводимости	Нет	Проводимость	Г алогены
Пламенно фотометрический	Пламя	Излучение	P.S
Атомно-эмиссионный	Разные	Излучение	Г алогены
Хемилюминисцентный	Нет	Излучение	Галогены, S, нитрилы
Катарометр	Нет	Сопротивление	Все
У Ф-фотометрический	Нет	Поглощение	Поглощающие в УФ
Флуориметрический	Нет	Флуоресценция Флуоресцирующие
Масс- спектрометрический	Разные	Отношение m/z	Все

Таблица 17

Основные типы детекторов, используемые при определении гербицидов

Пламенно-ионизационный детектор (ПИД) — основан на том, что электрическая проводимость газа-носителя, существенно возрастает благодаря ионам, образующимся при горении органических соединений в водородном пламени. Отклик ПИД пропорционален числу атомов углерода в молекуле, изменяется при переходе от одного класса органического соединений к другому незначительно. К достоинствам этого детектора относится простота в обращении, быстрый отклик, широкий линейный динамический диапазон и универсальность: он применим для определения всех гербицидов. Используется в газовой и жидкостной хроматографии.
Детектор электронного захвата (ДЭЗ), или электронно-захватный детектор (ЭЗД) - используют для определения галогенсодержащих гербицидов. В состав детектора входит радиоактивный источник малой интенсивности (63Ni), который испускает электроны высокой энергии. При ионизации молекул газа-носителя происходит возникновение электрического тока в ионизационной камере между парой электродов. Принцип действия этого детектора основан на уменьшении проводимости газа- носителя при попадании в него органических молекул, содержащих электроотрицательные функциональные группы (галогены, фосфор, нитрогруппы). Используется в газовой хроматографии.
В фотоионизационном детекторе ионизация вещества происходит под действием ультрафиолета. Возникающий электрический ток измеряется с помощью двух электродов. Используется для селективного определения ароматических углеводородов или органических веществ, содержащих гетероатомы. Используется в газовой хроматографии.
Детектор по электролитической проводимости (ЭПД) предназначен для определения галогенсодержащих гербицидов. Поступающее в детектор вещество восстанавливается водородом в никелевой реакционной трубке при 85°С с образованием газообразного галогенводорода, который, в свою очередь, растворяется в н-пропаноле. Изменение проводимости растворителя преобразуется в сигнал детектора. Используется в газовой хроматографии.
Пламенно-фотометрический детектор (ПФД) предназначен для определения серо- и фосфорсодержащих гербицидов. Принцип действия его основан на измерении интенсивности излучения фосфор- и серосодержащих соединений в пламени водород/воздух. Регистрация фотонов происходит с помощью фотоумножителя. При установке на фотоумножитель оптических фильтров с различной длиной волны детектор является селективным к серосодержащим соединениям (394 нм) или фосфорсодержащим соединениям (526 нм). Используется в газовой хроматографии. Разновидностью ПФД является пульсирующий пламенно-фотометрический детектор (ППФД), отличающийся тем, что в нём горение пламени происходит не постоянно, а импульсами, то есть вспышками, обычно с частотой 2-4 Гц. Периодический характер пламени позволяет проводить разделение фронтов свечения разных веществ во времени, например, серы на фоне углерода, то есть селективность ППФД значительно выше, чем у ПФД.
Атомно-эмиссионный детектор (АЭД) позволяет определять гало- генорганические гербициды. В детекторе анализируемое вещество атоми- зируется в высокоэнергетическом источнике, образовавшиеся возбужденные атомы излучают свет при возвращении в основное состояние. Переход возбужденных атомов в состояние с более низкой энергией сопровождается излучением света. Излучаемый свет с различными длинами волн диспергируется в спектрометре и измеряется посредством фотодиодной матрицы. Каждый химический элемент имеет свой собственный типичный эмиссионный спектр, в котором эмиссионные линии обычно образуют кластеры с постоянным соотношением интенсивностей внутри кластера. Используется в газовой хроматографии.
Хемилюминисцентный детектор. Как и в случае АЭД, измерение концентрации вещества ведется на основании излучении света возбужденными компонентами. Однако, в отличие от АЭД, при хемилюминис- ценции используется свечение возбужденных (энергизованных) молекул, а не атомов.

Используется в газовой и жидкостной хроматографии.
Детектор по теплопроводности (ДТП), или катарометр является универсальным детектором. В основу работы ДТП положен процесс передачи тепла от нагретого чувствительного элемента к более холодному корпусу детектора за счет теплопроводности газового потока. С изменением состава газового потока меняется его теплопроводность, т.е. количество тепла, отводимое от чувствительного элемента. Это, в свою очередь, приводит к изменению температуры, а, следовательно, и электрического сопротивления чувствительного элемента. В измерительной схеме ката- рометра возникает сигнал в виде разности потенциалов (напряжения), величина которого пропорциональна концентрации анализируемого вещества в газе-носителе. Особенностью ДТП, по сравнению с другими детекторами, является необходимость продувки его двумя потоками газа- носителя - по рабочей и сравнительной линии, в каждой из которых помещается два чувствительных элемента. Обе линии равноценны и могут быть как рабочей, так и сравнительной. В сравнительную линию ДТП подается, как правило, «чистый» газ-носитель из сравнительной колонки, в рабочую линию подается поток газа-носителя из рабочей (аналитической) колонки. Таким образом, в ДТП производится сравнение теплопроводностей «чистого» газа-носителя и газа-носителя, содержащего разделенные в рабочей колонке анализируемые вещества. Используется в газовой хроматографии.
УФ-фотометрический детектор позволяет проводить определение гербицидов, поглощающих в УФ области спектра. Различные виды этих детекторов являются одними из наиболее распространенных при определении гербицидов методами жидкостной хроматографии. УФ- фотометрич еские детекторы являются частным случаем фотометрических детекторов с переменной длиной волны 200-700 нм, в основу которых положен закон Бугера-Ламберта-Бэра.
Флуориметрический детектор - также является одним из наиболее распространенных детекторов в настоящее время. Принцип его действия использует способность ряда веществ светиться под действием возбуждающего излучения. При этом интенсивность наблюдаемой люминесценции пропорциональна интенсивности возбуждающего света и концентрации вещества.
Масс-спектрометры используют различия в отношении масса/заряд (т/е) ионизованных атомов или молекул для их разделения. Поэтому масс-спектрометрия может быть использована не только для определения концентрации аналита, но также и для определения химической и структурной информации о молекулах. Обязательными этапами масс- спектрометрии являются: ионизация пробы, разделение ионов в пространстве на основании отношения масса/заряд и измерение количества ионов с определенным отношением масса/заряд.
Среди масс-спектрального оборудования выделяют изотопные масс- спектрометры, предназначенные для высокоточного определения изотопных соотношений элементов и сканирующие масс-спектрометры, предназначенные для исследования структуры органических соединений и определения состава сложных смесей. «Органическая» масс-спектрометрия давно является одним из наиболее мощных методов исследования структуры веществ.
Иммуноферментные методы определения гербицидов
Иммуноферментный анализ (ИФА) - высокочувствительный иммунологический метод определения, основанный на конкуренции между свободным гербицидом, находящимся в образце, и его конъюгатом с белком, адсорбированным на твердой фазе. К основным преимуществам этого метода относятся простота выполнения, доступность и стабильность реагентов, экспрессность и возможность автоматизации для проведения массовых анализов [Иммуноферментный анализ, 1988].
Процесс иммуноферментного анализа можно условно разбить на три стадии: формирование специфического комплекса антиген-антитело; введение метки в комплекс антиген-антитело; визуализация метки в комплексе антиген-антитело.
В качестве универсальной метки для иммуноанализа в 1971 г. было предложено использовать ферменты [Engvall, Perlmann, 1971; Van Wee- men, Schuurs, 1971], поэтому сам анализ получил название ELISA (от англ. Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay - фермент-зависимый иммуно- сорбционный анализ).
С точки зрения выполнения ИФА можно разбить на две группы: системы, не требующие разделения компонентов (гомогенные методы); системы, для которых необходимо разделение компонентов (гетерогенные методы).
В системах, не требующих разделения, ферментативную активность анализируемого раствора измеряют без предварительного разделения меченых лигандов (определяемых веществ) на свободные и связанные с ан

тителами. При проведении гетерогенного ИФА получают две отдельные фракции меченого лиганда: связанную с антителами и свободную, и только потом измеряют активность этих фракций.
Принцип ИФА без разделения компонентов приведен на рис. 6.

Рисунок 6. Принцип ИФА без разделения компонентов с использованием в качестве метки лиганда, меченного ферментом. Г — свободный гербицид; Ат — антитела; Ат:Г - комплекс гербицида с антителами; Г — Ф — комплекс гербицида с ферментом (конъюгат); С — субстрат; П — продукт [Иммуноферментный анализ, 1988].

В заранее приготовленный раствор, содержащий специфические антитела (Ат) к лиганду, в качестве которого выступает гербицид, и комплекс гербицида, ковалентно связанного с ферментной меткой (Г — Ф, конъюгат), вносят исследуемый раствор, содержащий определяемый гербицид (Г). Начинаются две конкурирующие реакции: между гербицидом и антителами (реакция I) и между комплексом гербицида с ферментной меткой и антителами (II). В отсутствие гербицида в испытуемом растворе реакция I не происходит, поэтому в смеси образуется только комплекс Ат:Г- Ф, не обладающий ферментативной активностью, а комплекс Ат: Г отсутствует. Так как комплекс Ат:Г — Ф не обладает ферментативной активностью, а ферментативно активный комплекс Г-Ф полностью превращается в комплекс Ат:Г - Ф, то реакции III (индикаторной) превращения субстрата (С) в продукты (П) не происходит. Если же в испытуемой пробе содержится гербицид, то часть антител расходуется на образование комплекса Ат:Г вследствие чего в растворе остается несвязанный с антителами комплекс Г-Ф, катализирующий образование П. Таким образом, образование П прямо пропорционально содержанию гербицида в образце.
При проведении ИФА с разделением компонентов (гетерогенный анализ) получают две отдельные фракции меченого лиганда (связанную с антителами и свободную), проводят разделение этих фракций, а потом проводят определение активности этих фракций. Физическое разделение
связанной с антителами и свободной фракции является обязательным, так как анализ основан на распределении меченых конъюгатов между этими фракциями. Примером ИФА с разделением компонентов является ингибиторный ИФА (рис. 7).

Рисунок 7. Принцип ингибиторного ИФА с разделением компонентов. Г — свободный гербицид; Ат — антитела; ; | — Г — иммобилизованный гербицид; Г:Ат - Ф - комплекс гербицида с антителами, меченными ферментом; Ат - Ф - комплекс антител с ферментом; С - субстрат; П - продукт [Иммуноферментный анализ, 1988].

В этом методе иммоблизованнный гербицид ( ; | — Г) конкурирует с гербицидом анализируемого образца (Г) за присутствующие в постоянной концентрации антитела, меченные ферментом (Ат - Ф) (реакции I и II). Ферментативная активность комплексов ? | — Г:Ат — Ф обратно пропорциональна концентрации определяемого гербицида (реакция III). В отсутствие гербицида коньюгат Ат — Ф полностью связывается с В | — Г, поэтому ферментативная активность иммобилизованной фракции максимальна.
В настоящее время ИФА подходы разработаны для целого ряда гербицидов, включая хлоримурон-этил [Zhao et al., 2006], ацетохлор [Deryabina et al., 2005], бутахлор [Dzantiev et al., 2005], симетрин [Nishi et al., 2005] и др. Предел обнаружения гербицидов методами ИФА составляет единицы-десятки нг/мл.
Использование методов биотестирования для количественного определения гербицидов
Несмотря на высокую чувствительность существующих в настоящее время инструментальных методов определения, на основании получаемых данных о содержании гербицидов невозможно предсказать фитотоксичность почвы по отношению к сельскохозяйственным культурам - основному показателю, характеризующему приемлемость технологии и регламента внесения гербицидов. Поэтому для оценки суммарного воздействия

не только используемого гербицида, но также и продуктов его трансформации, следует использовать методы биотестирования.
Список наиболее чувствительных культур для гербицидов различных классов приведен в табл. 18. Как следует из вышеизложенного материала, гербициды обладают различными механизмами действия на растения. При выборе метода биоиндикации конкретного гербицида следует руководствоваться, прежде всего, знанием о механизме его действия. Например, при работе с гербицидами, ингибирующими рост проростков (ингибиторы митоза), оптимальным методом будет использование экспрессного метода проростков или методик с использованием колеоптилей или гипокотилей. Однако очевидно, что указанный метод неприменим при работе с гербицидами, действующими на фотосинтез. Так как для развития фотосинтетического аппарата растениям требуется не менее 10-14 дней, то необходимо проводить лабораторные или вегетационные эксперименты продолжительностью не менее 30-40 дней. Для гормоноподобных гербицидов возможно использование такого «экзотического» тест-отклика как степень искривления (в градусах) побега.
Таблица 18
Сельскохозяйственные культуры, рекомендуемые в качестве индикаторов фитотоксичности почвы, загрязненной гербицидами различных классов

Класс гербицидов	Чувствительные культуры
Триазины	Плевел gt; Люцерна gt; Овес gt; Пшеница gt; Соя gt; Сорго gt; Кукуруза
Трифлуралин	Рожь gt; Овес gt; Сорго gt; Кукуруза gt; Пшеница gt; Люцерна gt; Соя
Имазаквин	Рапс gt; Люцерна = Кукуруза = Подсолнечник gt; Сорго gt; Овес gt; Пшеница gt; Соя
Имазетапир	Рапс gt; Сорго gt; Подсолнечник gt; Овес gt; Пшеница gt; Кукуруза gt; Люцерна gt; Соя
Хлоримурон	Рапс gt; Люцерна gt; Подсолнечник gt; Сорго gt; Кукуруза gt; Овес gt; Пшеница gt; Соя
Кломазон	Овес = Пшеница = Люцерна gt; Подсолнечник = Сорго = Кукуруза gt; Соя

Знания о механизме действия гербицида, кроме того, позволяют наиболее корректно выбрать регистрируемый тест-отклик. Наиболее распространенными показателями обыкновенно являются длина и биомасса растений, так как вне зависимости от механизма действия внесение гербицида приводит к снижению этих показателей. Однако длина и биомасса являются брутго-показателями и в случае, когда необходимо получить более точные данные, возможно использование других тест-откликов.

Например, в случае с гербицидами, ингибирующими фотосинтез, возможно регистрировать токсичность препаратов непосредственно по показателям эффективности фотосинтеза: выделению кислорода, поглощению углекислого газа, флуоресценции. При работе с гербицидами, ингибирующими синтез аминокислот, гербицидную активность можно регистрировать по изменению состава и/или количества белков.
Кроме высших растений, в качестве тест-объектов, можно использовать бактерии, грибы, одноклеточные водоросли [Спиридонов и др., 2004].

<< | >>

Источник: Куликова Наталья Александровна, Лебедева Галина Федоровна. Гербициды и экологические аспекты их применения: Учебное пособие.. 2010

Еще по теме Методы определения гербицидов:

- Агрохимия и агропочвоведение - Животноводство и промыслы - Защита растений - Земледелие - Овощеводство - Плодоводство - Пчеловодство - Растениеводство - Сад и огород - Селекция и семеноводство с/х культур - Сельскохозяйственные мелиорации -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -