ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Спектр патогенности в естественных условиях. Впервые межвидовую передачу между вирусами гриппа человека и животных описал ветеринарный врач Косен в 1919 г. Основываясь на изучении изолятов ВГС с 1980 г. сделан вывод о том, что последние вспышки гриппа свиней обусловлены вирусом H1N1, тесно связанным с птичьим вирусом гриппа H1N1. Это показывает, что птичьи штаммы вируса гриппа способны инфицировать и вызывать заболевание у свиней. Штаммы ВГС H1N1 обусловили 84 вспышки заболевания у индюков с сильными респираторными поражениями и снижением яичной продуктивности. Циркуляция вирусов H1N1 имеет место среди следующих видов: утки, индюки, человек. Свиньи могут заражаться от птиц и людей (29), что позволяет говорить о свином вирусе “как о сосуде смеси” вирусов птичьего и человеческого происхождения. В последнее время, однако, многократно выделялся H2N2 от больных свиней в европейских странах; в США это редчайшее явление (4, 9,14,16,17, 22,27,29).

ДИАГНОСТИКА

Основана на клинических, эпизоотологических, патологоанатомических и лабораторных данных. Трудность распознавания гриппа свиней связана с тем, что вирусные респираторные болезни (инфекция Сендай, пневмонии хламидийной природы, аденовирусная инфекция), а также наличие микоплазмоза сопровождаются катаральными процессами в дыхательных путях. Атипично протекающий грипп свиней иногда может быть хроническим. Возможны случаи смешанной инфекции, когда поросята заражаются бактериальными и вирусными агентами. Сходство ВГЧ типа А и ВГС определило общие приёмы исследований в медицине и ветеринарии, иногда несколько различающиеся спецификой объектов.

Выделение вируса

Выделение вируса на лабораторных животных. Используют хорьков, белых крыс, но чаще белых мышей. В качестве исходного материала для выделения вируса используют кусочки лёгкого, трахеи, бронхиальный экссудат, носовые смывы от больных свиней.

Мышей заражают интразально под эфирным наркозом и в течение 5-7 дн наблюдают за ними, обращая внимание на общее состояние животных. Если животные не гибнут, их убивают. На вскрытии отмечают изменения в лёгких. Затем проводят ещё 3-4 пассажа. По мере адаптации вирулентность вируса для белых мышей значительно возрастает, они гибнут на 4-7-й, а иногда на 14-й день после заражения.

Выделение вируса на КЭ. Испытуемый материал инокулируют в аллантоисную или амниотическую полости 9-12-сут КЭ, которые после заражения инкубируют 48-72 ч, иногда до 96 ч при температуре 37°С. Для выделения вируса обычно проводят 2-3 слепых пассажа.

Выделение вируса в культуре клеток. Культура клеток почек поросёнка - универсальная биологическая система, применяя которую можно выделить вирус от больных свиней. Для быстрой индикации вируса гриппа в 1-слойных культурах почечного эпителия поросят используют РГАД с эритроцитами курицы, морской свинки или 0-группы человека. Г Ад, положительная РГА, а также дегенеративные изменения клеток указывают на присутствие вируса в исследуемом материале. Вирус, вызвавший явление Г Ад, должен адаптироваться к КЭ и вызывать накопление ГА.

Индикация и идентификация вируса. Вирусоскопию, ЭМ и ИЭМ в диагностической практике не применяют (1,2).

Риноцитоскопия. Со слизистой оболочки носа делают мазки-отпечатки. Положительный диагноз ставят на основании обнаружения в отпечатке в первые 1-3 дн болезни большого количества клеток цилиндрического эпителия. Позднее содержание цилиндрических клеток в мазке уменьшается. Вопрос о диагностическом значении цитоплазматических включений при гриппе свиней неясен; в литературе нет достаточно обоснованных сообщений.

Обнаружение вируса в РГА. При постановке РГА обычно используют эритроциты кур или морской свинки. Берут 0,5 мл носового смыва, добавляют 0,5 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов, тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 1-2 ч. Результаты реакции учитывают общепринятым методом. Чувствительность реакции можно повысить, увеличив объем испытуемых смывов. РГА со смывами используют только при массовом заболевании гриппом, так как процент специфических реакций не превышает 30. Серологическая идентификация

РСК. Все ранее выделенные эпизоотические штаммы ВГС относятся к типу А. Однако это не исключает возможности обнаружения вируса гриппа иной типовой принадлежности, поэтому тип выделенных вирусов определяют в РСК. Данную реакцию используют при выделении вируса, идентификация которого не удается с помощью РТГ А. В этом случае в РСК с эталонными иммунными сыворотками против гриппа типов А, В и С устанавливают типовую принадлежность выделенного вируса. В Ленинградском институте им. Пастера предложена усовершенствованная методика РСК для идентификации вирусов гриппа, в которой используют иммунные типовые сыворотки морских свинок (коммерческие лошадиные типоспецифические сыворотки для этой цели непригодны). В РСК применяют две дозы комплемента. Использование в реакции сыворотки морской свинки и аллантоисного АГ не требует титрования комплемента в их присутствии, так как они не обладают антикомплемен- тарными свойствами. При идентификации вирусов гриппа РСК не заменяет РТГ А. Позволяя установить типовую принадлежность штаммов, РСК не вскрывает различий между ними.

ИФ. ИФ (прямой и непрямой варианты) используют для быстрого обнаружения АГ вируса в патологическом материале и в биологических системах, в которых проводят выделение вируса (КЭ, лабораторные животные, культура клеток). Локализация вирусного АГ характеризуется вначале нежной диффузной флюоресценцией в ядре, затем в перинуклеарной зоне. Постепенно мелкогранулярное свечение распространяется по всей цитоплазме, а внутриядерное - ослабевает. Методика постановки ИФ общепринятая.

РТГА. Идентификацию выделенного на КЭ вируса проводят с набором штаммоспецифических сывороток с использованием эритроцитов кур. РТГ А ставят по общепринятой методике. Сыворотка, задерживающая РГА до разведения не меньше четверти ее гомологич- Сыворотка к вирусу гриппа Г омологич ный титр шт. №2 титр отношен шт.№ 3 титр отношен шт.№ 4 титр отношен Шт. №1 типа А 1:320 1:80 0,25 1:160 0,5 1:40 0,125

В данном примере штаммы № 2 и 3 принадлежат к ВГС типа А и родственны штамму № 1, так как сыворотка к этому штамму нейтрализует ГА активность штаммов 2 и 3 соответственно до 0,25 и 0,5 своего гомологичного титра (1:320).

PH. Ставят, главным образом, в КЭ, где хорошо размножаются вирусы гриппа. Применение ее на мышах весьма ограничено ввиду того, что немногие штаммы вируса гриппа патогенны для мышей. PH может быть поставлена в 2-х вариантах по общепринятой методике.

ИФА. Внрусспецифические АГ выявлялись в ИФА в цитоплазме ФКЭ и клеток эпителия дыхательного тракта мышей в виде гранул желтого цвета. Установлена высокая чувствительность метода. Недавно иммуноферментная методика модифицирована. Стало возможным использовать ее для выявления Г А вируса гриппа как в составе вирусных частиц, так и в изолированном из вирионов состоянии. Модификация основана на прямой адсорбции вирионов гриппа и вирусспецифических белков на полистироловых гранулах. Определены параметры тест-системы для реализации ее максимальной чувствительности. Эффективность выявления ГА зависит от сорбционных свойств ГА содержащих вирусных препаратов. Для интактных вирионов гриппа максимальная чувствительность тест-системы равна 1-

2 нг ГА в образце. Разработан экспресс-вариант методики, позволяющий выявить 30-40 нг ГА в образце при полной продолжительности анализа около 4 ч.

Метод молекулярной гибридизации. Применяют для анализа носоглоточных смывов, полученных от заболевших в период эпидемиологического подъема заболеваемости гриппом, что позволяет рекомендовать его для использования в эпизоотологическом анализе. С помощью РТГ А с использованием наборов монАТ, метода ПЦР и секвенирования ее продуктов, продемонстрирована высокая система АГ- и генетической консервативности ГА изолятов ВГС, полученных в 1986-1991 гг. (26).

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. При ретроспективной диагностике важно выяснить, отмечалась ли циркуляция вируса гриппа у животных на данной ферме. Для этого исследуют кровь 10-20 свиней на присутствие анти-ГА. Начиная с 7-10-го дня после начала болезни в крови реконвалесцентов появляются АТ. ВНА у свиней появляются на 6-7-й день. Максимальный титр их обычно бывает между 14-м и 27-м дн.

РТГА. Обнаружение анти-Г А в крови переболевших животных - наиболее простой, достаточно точный и пригодный метод проведения единичных и массовых исследований при диагностике гриппа. Для этого при помощи РТГ А определяют сдвиг специфических АТ в парных сыворотках, взятых от животных в различные сроки после переболевания. Получают от каждого больного животного две пробы сыворотки: в первые дни болезни (1 проба) и в период реконвалесценции (2-я проба). Интервал между взятием 1-й и 2-й проб должен быть не менее 8-14 дн. Если в сыворотке, полученной от больных свиней в стадии выздоровления (через 14-30 дн после начала болезни), количество АТ возросло по сравнению с исходным уровнем в 1-й сыворотке, взятой в первые дни болезни, в 4 раза и более, то это свидетельствует о том, что вспышка гриппа прошла. Анти-ГА в крови экспериментально зараженных поросят образуются во всех случаях на 8-10-й день, на 21-й день наблюдается некоторое снижение их титра, и к 40-му дню титры их в РТГА колеблются от 1:8 до 1:32.

Сыворотки перед исследованием прогревают при 60°С 30 мин, освобождают от термостабильных ингибиторов (обработкой ССЬ) и неспецифических АГ (адсорбцией с помощью эритроцитов кур). РТГ А ставят общепринятым методом с 4 Г АЕ вируса. Для удаления не- специфическйх ингибиторов из сывороток, содержащих АТ к вирусу гриппа, в Румынии запатентован способ обработки, в котором используют фильтрат Clostridium welchii, позволяющий с большей надежностью получить сыворотки без ингибиторов, но сохранившие исходные концентрации специфических АТ. Использование рекомбинантного вируса, устойчивого к неспецифическим сывороточным ингибиторам, позволяет исследовать сыворотки без их предварительной обработки. При сопоставлении чувствительности РТГ А и ИФА была установлена их равноценность в выявлении числа сероконверсии к вирусам гриппа, однако величина титров АТ, по данным РТГ А, была в 2 раза ниже, чем в ИФА.

PH. Ставят ее в монослойной культуре клеток, для чего используют адаптированный штамм с хорошо выраженным ЦПД. Испытуемые сыворотки инактивируют 30 мин, а для реакции используют 100 ТЦД50 вируса; смеси инкубируют при температуре 37°С 30 мин. При необходимости PH ставят и на КЭ по общепринятой методике. В США PH по подавлению бляшкообразования вирусами гриппа Al, А2 и В в перевиваемой линии клеток почек собак оказалась в 100 раз чувствительнее, чем РНГА.

Перед постановкой реакции сыворотки разводят от 10'1 до 10'8 и инкубируют с 60-160 БОЕ индикаторного вируса гриппа в течение 1 ч при 34-36°С. Затем смеси вносят в чашки Петри с культурой клеток почек собак, выращенной в среде Игла при добавлении глутамина и нормальной телячьей сыворотки. На клетки наслаивают среду покрытия (среда Игла с 50% декстрозы, 1% декстрана и 0,1% трипсина), затем чашки в течение 2-5 дн инкубируют при 34-36°С в атмосфере с 5% СОг К вирусу гриппа Al чувствительна только 1-дн культура, а к вирусу А2 - 2-дн культура клеток почек собак. Указанная модификация PH удобна тем, что не требует освобождения сывороток от неспецифических ингибиторов и выявляла АТ в сыворотках, в которых не удавалось обнаружить АТ с помощью РТГ А.

РРГ. Более чувствительна, чем РТГ А. Она была предложена для определения титра АТ в сыворотках свиней, для чего из свежеотмытых эритроцитов цыплят готовят 10%-ную суспензию на фосфатном буфере pH 7,2. Вирус гриппа А, выделенный от свиней (шт. А/свинья/Висконсин/15/30), в форме аллантоисной жидкости, содержащей 1024 ГАЕ в 0,05 мл, добавляют к равному объему суспензии эритроцитов. Смесь выдерживают 10 мин при 4°С, а затем дважды отмывают и ресуспендируют. Готовят расплавленную 1,5%-ную агарозу (А-37), содержащую 0,1% азида натрия. Затем к 4,5 мл суспензии эритроцитов с адсорбированным вирусом добавляют 1 мл комплемента и смешивают с 24,5 мл расплавленной и охлажденной до 45°С агарозой. После застывания среды вырезают луночки диаметром 3 мм. Каждую луночку заполняют исследуемой сывороткой и пластины выдерживают ночь во влажной камере при 4°С, а затем инкубируют 3 ч при 37°С. Испытуемые сыворотки перед исследованием инактивируют 30 мин при 56°С. О наличии АТ к вирусу судят по образованию зоны лизиса вокруг луночек. Установлена корреляция титров АТ в полевых и экспериментальных сыворотках, выявленных при использовании РРГ и РТГА.

Описанный метод прост и быстро выполним. Неспецифическая ингибиция свиных сывороток снимается при прогревании. РРГ оказалась более чувствительной при выявлении АТ к слабоавидным штаммам вируса А/Виктория/3/75 и В/Анон/2114/76. При правильном подборе штамма вируса РРГ может быть с успехом использована для определения антиней- раминидазных АТ при массовых обследованиях на грипп.

РНГА. При серодиагностике гриппа эта реакция позволяет выявлять АТ в значительно более высоких разведениях сывороток, чем РСК и РТГА (в 35 и 10 раз соответственно). Различия между показателями в РНГА и PH не превышали 1,1%. Благодаря высокой чувствительности РНГ А давала возможность регистрировать сероконверсию раньше, чем другие серологические методы. ELISA применительно к гриппу свиней не разработан. РСК не нашла широкого практического применения из-за трудностей, связанных с прокомплементар- ными свойствами сывороток свиней.

Дифференциальная диагностика. Трудность распознавания ВГС связана с тем, что вирусные респираторные болезни (инфекция Сендай, пневмонии хламидиозной природы, аденовирусная инфекция и пр.), а также микоплазмоз сопровождаются катаральными процессами в дыхательных путях. Атипичные формы гриппа свиней иногда могут протекать хронически и напоминают вирусную пневмонию свиней (весьма собирательный термин прошлого, под которым могут скрываться пневмонии разной этиологии). В последнее время установлено, что гриппоподобные болезни свиней могут быть обусловлены микоплазмами. Поэтому необходимо строго дифференцировать респираторные болезни свиней, из которых, по-видимому, лишь некоторые, по крайней мере в странах восточного полушария, могут быть обусловлены истинньм вирусом гриппа свиней, открытого Шоупом. Свинопоголовье может явиться как резервуаром для сохранения и возникновения эпидемических вариантов, так и промежуточным звеном в ходе эпидемического и эпизоотического процессов (3).

ИММУНИТЕТ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

Продолжительность иммунитета у свиней-реконвалесцентов не изучена. Анти-ГА и ВНА в крови выявляются до 8-10 мес. Для профилактики ГС в ряде стран используются инактивированные вакцины, обеспечивающие достаточно напряженный иммунитет. Свиньи, привитые дважды вакциной Suvaxyn Flu-3, приобретают полную устойчивость к экспериментальному заражению. В организме вакцинированных свиней гомологичный вирус не размножался. В случае возникновения заболевания проводят поголовную вакцинацию свиней (18). Разработка и испытание инактивированных вакцин для профилактики ГС продолжаются (11, 28, 34). Живой, температурочувствительный штамм ВГС обеспечивал некоторую защиту свиней (11). Gourean и др. (12, 13) описали инактивированную адъювант- вакцину против ГС (H1N1), которая превосходит жидкую инактивированную вакцину. АТ не её введение выявлялись через 15 дн и сохранялись до 2 мес после вакцинации. При 2-й инокуляции (бустериммунизации) АТ сохранялись до 8 мес (12, 13). О выявления поствакцинальных АТ и зависимости устойчивости вакцинированных животных от уровня гуморальных АТ в доступной нам литературе не найдено.

СПИ СОК ЛИТЕРАТУРЫ 1.

Сюрин В.Н. и др. Част. Вет. вирус., М., ’’Колос”, 1979. 2.Сюрин В.Н. и др. Диагн. вирусн. бол. жив., М., Агропромиздат, 1991. З.Жуматов К.Х. и др. Труды инст. микроб, и вирус. АН Каз. ССР, 1991, 37 :48. 4.Andral В. et.al. Vet Rec, 1985, 116 :617. 5.Bachmann P.A. Sv infl virus. In Virus Inf Por, Ed. Pensert et.al., Amsterdaml989 :193. 6.Bikons M.H. et.al. J Gen Virol, 1995, 76, 10 :2539. 7. Brown T.T. et.al. - Am J Vet Res, 1982, 43 :817. 8. Brown T.T. et.al. - Vet Pathol, 1980, 17, :455. 9. Castro J.M. et.al. Vet Rec, 1988, 122(17) :418. 10.Dasco S.S. et.al. Abstr Ann Meet, Am Soc Microbiol, 1980, 80 :288. ll.Easterday B.C. et.al. J Inf Dis, 1977, 136 (Suppl) :699. 12.Gourrean J.M. et.al. Ann Virol, 1981, 2 :287. 13.Gourrean J.M. et.al. - Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 1980, 3 :147. 14.Haesebrouck F. et.al. Am J Vet Res, 1985, 46(9) :1926. 15.Haugegaard J. Den Veterinaertidsskr, 1993, 76, 19 :829. l?.Hinshaw V.S. et.al. Bull WHO, 1984, 62 :871. 17.Hinshaw V.S. et.al. Sciense, 1983, 220 :206. 18.Kuiper A. Pigs, 1979, 3,

5 :31. 19.Kyriakis S.C. et.al. Bull Hell Vet Med Soc, 1992, 43, 2 :89. 20.Lopez J.W. et.al. Pigs, 1987, 4 :48. 21.Madec F. et.al. Comp Imm Microbiol Infect Dis, 1989, 12(1/2) :17. 22.Mohan R. et.al. Avian Dis, 1981, 25 :11. 23.Morin M. et.al. Canad Vet J, 1990, 31, 12 :837. 24.Murphy B.R. et.al. Inf Viruses In Virology. Ed Fields, N.Y., 1990 :1091. 25.Newmier E. et.al. Virus Res, 1992, 23, 1-2 :107. 26.Noble S. et.al. J Gen Virol, 1993, 74, 6.1197. 27.Pritchard C.C. et.al. Vet Rec, 1987, 121 :548. 28.Pirtle E.C. J Inf Dis, 1977, (Suppl), 136 :703. 29.Scholtissec C. et.al. Nature. 1988, 331 :215. 30.Sherrar M.G. et.al. J Gen Virol, 1989, 70 :3297. 31.Sugita S. et.al. Anim Inst Genet, Jap, 1991, 42 :86. 32.WHO, 1980, Bull WHO, 58 :585. 33.Witte K.H. et.al. Tierarztl Umsch, 1981, 36 :591. 34.Wood G.T. Bovine Practic, 1980, 1 :41.