Определение неорганического фосфора в сыворотке крови с ва- надат-молибденовым реактивом (по Пулсу в модификации В. Ф. Коромыслова и Л. А. Кудрявцевой).  

дат-молибденовым реактивом. Степень окраски измеряют на фотоэлектроколориметре.

Реактивы: 20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; реактив на фосфор.

основной стандартный раствор фосфора. 4,394 г однозамещен- ного фосфорнокислого калия (КН2РО4 х. ч., ч. д. а.), высушенного до постоянной массы в эксикаторе над концентрированной серной кислотой, растворяют в 1 л дистиллированной воды. 1 мл раствора содержит 1 мг фосфора;

5 мг%-ный рабочий стандартный раствор фосфора. 5 мл основного стандартного раствора фосфора доводят в мерной колбе на 100 мл дистиллированной водой до метки.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; колбы конические термостойкие на 1 л; колбы мерные на 50, 100, 500, 1000 мл; электроплитка; пипетки; пробирки; центрифуга.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят

5. мл дистиллированной воды, 0,5 мл сыворотки, 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и через 10 мин центрифугируют 15 мин при 3000 мин-1.
   С помощью шприца и пипетки, не затрагивая осадка, берут 2,5 мл центрифугата, добавляют 2,5 мл реактива на фосфор, перемешивают и через 10 мин колориметрируют на ФЭКе с синим светофильтром в кювете с толщиной слоя 1 см против дистиллированной воды. Параллельно готовят стандартную пробу: к 0,5 мл рабочего стандарта 5 мг%-ного раствора фосфора добавляют 2,5 мл дистиллированной воды и 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты, смешивают. Затем берут 2,5 мл этого раствора, вносят в пробирку, добавляют 2,5 мл реактива на фосфор и через 10 мин колориметрируют в том же режиме, что и пробу сыворотки. Расчет ведут по формуле

х = (А/Б) • 5,

где х — количество фосфора, содержащегося в 100 мл сыворотки, мг; А — экстинкция испытуемого образца; Б — экстинкция стандартного раствора; 5 — коэффициент для перевода в мг%.

Для выражения содержания фосфора в ммоль/л в качестве коэффициента берут 1,615 или величину в мг% умножают на 0,323 (приложение 4).

Примечание. Сыворотка должна быть отделена от эритроцитов не позже чем через 1 ч после взятия крови. Она должна быть свободна от гемолиза, липемии, жел- тушности. Допустимо хранение сыворотки или плазмы в течение 1 сут при комнатной температуре, 4 сут при — 4—8 °С.

Клиническое значение. Фосфор — один из основных структурных элементов организма. Все виды обмена в организме неразрывно связаны с превращением фосфорной кислоты. Фосфор входит в структуру нуклеиновых кислот, благодаря фосфори- лированию осуществляется кишечная адсорбция, гликолиз, прямое окисление углеводов, транспорт липидов, обмен аминокислот и т. д. Макроэргические фосфорные соединения, среди которых центральное место занимает АТФ, — универсальные донаторы и аккумуляторы энергии. 80—85 % фосфора содержится в скелете. В крови он присутствует в неорганической и в органической формах. Органический фосфор связан с белками и липидами. Всего в крови животного и человека содержится около 10 фракций фосфорных соединений.

В клинической практике диагностическое значение имеет неорганический фосфор.

Снижение уровня фосфора в крови отмечается при длительном недостатке его в рационе, плохом усвоении, при расстройствах желудочно-кишечного тракта или дефиците витамина О, при гиперфункции паращитовидных желез и гипофункции щитовидной железы, когда увеличивается секреция паратгормона и уменьшается выработка кальцитонина. Отмечается оно и при алиментарной остеодистрофии, рахите, уровской болезни, пеллагре, длительном лечении инсулином, кальция хлоридом, болезнях желудочно-кишечно- го тракта.

Повышение уровня фосфора в крови может быть вызвано уменьшением секреции паратгормона, когда тормозится реабсорбция фосфора в почках. Увеличение кальцитонина стимулирует реабсорбцию фосфора в почках и приводит к гиперфосфатемии.

Гиперфосфатемия встречается при сердечной недостаточности, кетозе, приеме больших доз витамина б, нефрите, нефрозе, токсикозах беременности, мышечном перенапряжении. У телят молочного периода содержание фосфора в крови несколько выше, чем у взрослых животных. Содержание фосфора в безбелковом фильтрате цельной крови, плазмы и сыворотки, обработанных одновременно, одинаково.

Определение неорганического фосфора в сыворотке кровн животных с аскорбиновой кислотой. Принцип. В безбелковом центрифугате неорганический фосфор реагирует с молибденовой кислотой с образованием фосфорно-молибденовой кислоты, которая восстанавливается аскорбиновой кислотой до синего фосфорно-молибденового комплекса. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации неорганического фосфора.

Реактивы: хлорная кислота — 20 мл;

50%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) — 100 мл (флакон № 1);

5%-ный раствор молибдената аммония — 100 мл (флакон № 2);

аскорбиновая кислота — 1 г (флакон № 3);

основной стандартный раствор фосфора — 100 мг% (ампула);

1 н. соляная кислота — 10 мл.

Подготовка рабочих растворов.

5%-ный раствор молибдената аммония (флакон № 2) готов к применению.

0,1 н. раствор соляной кислоты: содержимое флакона (10 мл) 1 н. соляной кислоты переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят дистиллированной водой до метки.

Раствор аскорбиновой кислоты: содержимое флакона № 3 растворяют в 100 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты. Раствор готовят перед использованием.

Рабочий калибровочный (стандартный) раствор фосфора: в мерную колбу на 100 мл вносят 5 мл (ампула) основного калибровочного раствора фосфора и доводят объем дистиллированной водой до метки. Получают 5 мг%-ный (50 мг/л) раствор фосфора.

Ход определения. Опытная проба. В центрифужную пробирку вносят 2,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл сыворотки крови и 3 мл 10%-ного раствора ТХУ. Перемешивают стеклянной палочкой. Через 10 мин центрифугируют 20 мин при 3000 мин . Осторожно с помощью шприца отбирают 3 мл центрифугата, добавляют 0,6 мл раствора молибдената аммония, 0,12 мл раствора аскорбиновой кислоты и 1,3 мл дистиллированной воды. Перемешивают и через 20 мин колориметрируют в кювете с толщиной слоя

1. см при красном светофильтре (630—690 нм) против контроля.

Контроль. К 3 мл 10%-ного раствора ТХУ добавляют 0,6 мл раствора молибдената аммония, 0,12 мл раствора аскорбиновой кислоты, 1,3 мл дистиллированной воды.

Калибровочный раствор. Перемешивают 2,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 5 мг%-ного раствора фосфора, 3 мл 10%-ного раствора ТХУ. Через 30 мин 3 мл этой смеси переносят в другую пробирку, добавляют 0,6 мл раствора молибдената аммония, 0,12 мл раствора ас-

где х — количество неорганического фосфора, мг/100 мл; Еоп — экстинкция опытной пробы; Е„ — экстинкция 5 мг/100 мл раствора фосфора; 5 — коэффициент для перевода в мг/100 мл (мг%).

При переводе мг% в ммоль полученную величину умножают на 0,323.

Источник: 27.