БАКТЕРИИ РОДОВ PSEUDOMONAS И AZOTOBACTERКАК ПРЕДСТАВИТЕЛИ ГРУППЫ PGPR

У ризосферных псевдомонад наиболее хорошо изучена способность к синтезу ИУК, стимулирующей развитие корневой системы растений.

N.S. Iacobellis и др. [1990] осуществили выделение биологически активных соединений из Pseudomonas syringae pv. papulans, P. amygdali и P. syringae. Из подкисленной КЖ бактерий Р. amyg- dali выделены ИУК, ее метиловый эфир, m/мшс-зеатин, изопен- тениладенин и дигидрозеатин. При исследовании щелочного экстракта выделен и охарактеризован новый цитокинин - 2-дезокси- зеатинрибозид.

Е.А. Мордухова и др. [1991], изучив коллекцию из 216 штаммов ризосферных бактерий р. Pseudomonas на способность продуцировать ИУК, выявили гетерогенность популяции псевдомонад по этому признаку.

Псевдомонад, выделенных из ризосферы разных растений на обедненной азотом среде, испытывали на их способность к образованию сидерофоров, факторов роста, ферментов. Большинство штаммов синтезировали ИУК, 9 из 40 псевдомонад оказали значительное влияние на рост растений [Forlani et al., 1995].

М.О. Холмецкая и др. [1996] исследовали способность к синтезу ИУК у фитопатогенных видов псевдомонад.

мосвязи между патогенностью и ИУК-продуцирующей способностью штаммов р. Pseudomonas не выявило явной корреляции этих признаков.

Изучение динамики синтеза ИУК и условий, оптимальных для накопления в среде максимума гормона, показало, что синтез фитогормона псевдомонадами стимулируется добавлением в среду триптофана или триптамина и подавляется ионами аммония [Мордухова и др., 1991]. Выращивание в периодическом режиме продуцентов ИУК ризосферных бактерий Р. fluorescens 20 и Р. putida 23 выявило два максимума в накоплении ИУК, соответствующих 9 и 40 ч культивирования [Олюнина, Шабаев, 1996].

При изучении влияния ИУК ризосферных псевдомонад на растения в условиях водной культуры была обнаружена индукция выделения фенолов корнями кукурузы при введении ИУК в среду выращивания. Предполагается, что выделение в среду фенолов является ответной реакцией растения на воздействие со стороны ростстимулирующих бактерий р. Pseudomonas [Шабаев и др., 1999].

Исследования синтеза ИУК у псевдомонад показали возможность получения генетически модифицированных штаммов PGPR Pseudomonas, способных к повышенному синтезу ИУК. Это может быть осуществлено за счет переноса в PGPR Pseudomonas некоторых плазмид биодеградации нафталина, что обусловлено наличием в составе этих плазмид гена, ответственного за синтез нафталиндиоксигеназы (первого фермента в пути окисления нафталина), вовлекаемого в процесс биосинтеза ИУК [Мордухова и др., 1998].

Существует огромное число публикаций, посвященных демонстрации роли сидерофоров, продуцируемых флуоресцирующими псевдомонадами, в подавлении грибов р. Pythium, комплекса микромицетов, вызывающих корневые гнили, Colletotrichum spp. и др. [Swinburne, 1985; Campbell et al., 1986; Weller, Cook, 1986; Becker, Cook, 1988; Loper, 1988; Comelis et al., 1990]. В своей работе Cook и др., [1986] подчеркивают, что мутанты псевдомонад, утратившие способность к синтезу сидерофоров, лишаются фунгицидной активности, хотя сохраняют способность к колонизации почвы и корней пшеницы.

По мнению следующих авторов [АЫ et al., 1986; Colin, Maraite, 1987; Jacque et al., 1990], исследование биохимии сидерофоров псевдомонад еще не завершено, а их роль в борьбе с патогенами растений далеко не так одназначна. Четкой корреляции между способностью микроорганизмов к синтезу сидерофоров, их концентрацией и антагонистической активностью до сих пор не вы- зо

явлено. Так, свободные от железа хелатообразующие соединения штамма Р. fluorescens не влияли на прорастание эндоконидий, хламидоспор и мицелиальный рост патогена, но в комплексе с Fe3+ сильно подавляли мицелиальный рост и прорастание спор. Свободное железо было менее токсично по отношению к патогенам, чем связанные с железом хелатообразующие соединения. Но последние, по мнению авторов [Ahl et al., 1986], токсичны не потому, что они истощают запасы железа, а из-за того, что увеличивают его концентрацию до наиболее токсичного уровня.

Отмечается роль сидерофоров и в подавлении различных бактериальных поражений [Смирнов и др., 1990; Henry et al., . М.В. Henry и др. [1991] считают, что железохелатирующие сидерофоры, образуемые антагонистами, нельзя принимать за единственный фактор, ответственный за угнетение роста патогена, если бактериальные штаммы выделяют антибиотические вещества.

В настоящее время существует большое число публикаций, посвященных изучению способности представителей р. Pseudomonas к фиксации атмосферного азота. Особенно интенсивно изучаются вопросы эффективности применения азот- фиксаторов-псевдомонад в современном сельском хозяйстве.

При инокуляции азотфиксирующими псевдомонадами установлено усиление нитрогеназной активности в ризосфере различных сельскохозяйственных культур (как бобовых, так и не бобовых) и увеличение их урожая [Бурлуцкая и др., 1991; Лукин и др., 1995; Смолин, Сафрина, 1995; Шабаев и др., 1998, 1999; Kloepper, Schroth, 1981; Suslov, Schroth, 1982; Kloepper et al., 1988].

В лабораторном опыте без растений было показано, что внесение в почву азотфиксирующих бактерий Р.

Повышение урожая рапса, столовой свеклы, а также сои при применении псевдомонад исследователи объясняют тем, что наряду с улучшением азотного питания растений происходит также увеличение выноса ими других макро- и микроэлементов [Минеев и др., 1991; Смолин, Шабаев, 1992; Шабаев, Смолин, 1999].

Изучение влияния бактерий р. Pseudomonas на физиологобиохимические процессы в растениях показало, что усиление азотфиксации в ризосфере столовой свеклы и редиса при инокуляции псевдомонадами сопровождалось повышением интенсивности фотосинтеза в результате увеличения площади листьев [Минеев и др., 1992; Шабаев и др., 1998].

При изучении влияния инокуляции бобовых бактериями р. Pseudomonas установлено усиление клубенькообразования у сои [Nishijima et al., 1988] и фасоли [Grimes, Mount, 1984].

Эффект от применения микроорганизмов-диазотрофов в значительной степени зависел от формы и доз минеральных удобрений. Установлено, что при внесении нитратного азота в отличие от его аммонийной формы интродукция стимулирующих рост растений ризосферных псевдомонад сопровождается большим увеличением размера популяции данных бактерий [Samiguet et al., 1992].

По данным ряда исследователей, микроорганизмы-стимуляторы роста не являются альтернативой минеральным, в том числе азотным, удобрениям. Как правило, урожаи сельскохозяйственных культур, инокулированных данными микроорганизмами, ниже, чем при внесении в почву минеральных удобрений. Но в то же время применение повышенных доз минеральных удобрений с целью получения высоких урожаев сельскохозяйственных культур приводит к изменению химического состава растительной продукции [Алексеев, 1978].

Бактерии р. Azotobacter являются одним из эффективных стимуляторов для разных видов растений [Антипчук и др., 1985; Са- дыков и др., 1985; Хабиров, 1993], что объясняется их способностью фиксировать молекулярный азот, синтезировать витамины и гормоны роста [Антипчук и др.., 1985], проявлять антагонистическую активность против фитопатогенов [Мишустин и др., 1969; Придачина и др., 1982; Антипчук и др., 1985]. Показано, что бактерии Az. chroococcum способны подавлять развитие широкого

спектра фитопатогенных грибов [Pandey, Kumar, 1990]. Кроме того, при использовании биоудобрений на основе азотобактера было отмечено увеличение количества и качества урожая [Че- мерисов, 1988], а также накопление азота в почве [Шабаев и др., 1990].

Положительное влияние азотобактера на высшие растения связывают с его способностью улучшать азотное питание растений и продуцировать биологически активные вещества, подавляющие патогены и стимулирующие рост растений. Степень положительного влияния интродуцированных штаммов азотобактера на сельскохозяйственные растения часто тесно зависит от вида и даже сорта растения и способности штамма колонизировать корни в течение вегетационного периода. Бактерии р. Arotobacter - свободноживущие микроорганизмамы, т.е. они не способны проникать в ткани растений, обитая в ризосфере растений, а вплотную зависят от вида и величины корневого опада, конкурируя с остальными обитателями ризосферы за питательные вещества.

Большое количество работ посвящено положительному влиянию инокуляции посадочного материала сельскохозяйственных культур штаммами азотфиксирующих бактерий, в том числе бактерий р. Azotobacter. Так, положительное влияние на прорастание и устойчивость к заболеваниям семян огурца было отмечено на уровне высокого инфекционного фона [Антипчук и др., 1985], в условиях закрытого грунта инокуляция смешанной культурой, состоящей из штаммов псевдомонад и азотобактера, повысила урожай огурца на 44% [Егоров и др., 1994]. Обработка семян огурца азотфиксирующей бактерией Clostridium sp. стимулировала развитие, причем при двухкратной обработке стимуляция была более очевидной, обработанные растения зацвели на 10 дней раньше контрольных [Полянская и др., 2002].

Существуют данные, что экссудаты корней томатов угнетают развитие азотобактера [Мишустин, Шильникова, 1968], но в то же время ряд авторов указывает на стимуляцию развития растений томатов и повышение урожая при обработке чистыми культурами азотобактера [Dibut et al., 1997; Aguilar, Sanchez, 1998], причем бактеризация азотобактером совместно с известкованием и добавлением перегноя существенно повышала урожай . Также отмечали улучшение качества урожая томатов, которое характеризовалось увеличением сухого вещества, общего сахара, витамина С, каротина, и устойчивость к фитофто- розу при обработке рассады азотобактером [Плетнева и др., 1998].

В результате обработки клубней картофеля штаммами азотобактера повысился урожай [Сидоренко и др., 1996; Sood, Sharma, 2001] и изменилось его качество (повысилось содержание незаменимых аминокислот и крахмала) [Zahir et al., 1997].

Многие исследователи отмечали прибавку урожая пшеницы при ее инокуляции азотобактером, связанную как с азотфиксаци- ей, так и с действием ростстимулирующих веществ, продуцируемых микроорганизмами [Терехов, Ежова, 1997; Нурмухаметов, Нагимова, 1998; Лихолат, Шишова, 2000; Konde, Desai, 1976; Sindhu et al., 1994; Rabie et al., 1995; Shanshoury, 1995; Tomar et al., 1998]. Также было отмечено увеличение урожая (130%) при опрыскивании растений пшеницы в модельном эксперименте азот- фиксирующими бактериями, однако в полевых условиях при трехкратном опрыскивании этими микроорганизмами прибавка урожая пшеницы составила 33%, что эквивалентно эффекту от внесения 60 кг/га азотных удобрений. Другие исследователи после опрыскивания в полевых условиях получили прибавку урожая зерна пшеницы в 70% (4 ц/га). Сообщалось, что после опрыскивания листьев высокоурожайного. сорта пшеницы Kalyansona смесью азотфиксирующих микроорганизмов прибавка урожая зерна составила 10-20% при повышенном почти вдвое содержании белка в зерне [Чемерисов, 1988].

Комплексная предпосадочная обработка семян микроорганизмами р. Azotobacter в сочетании с другими группами PGPR-ми- кроорганизмов также положительно влияла на показатели урожая пшеницы [Shanshoury, 1995; Нурмухаметов, Нагимова, 1998]; так, в сочетании с фосфорными бактериями азотобактер в вегетационных опытах вдвое увеличил урожай зерна пшеницы [Чемерисов, 1988]. Обработка семян томатов бинарной культурой, состоящей из штаммов азотобактера и фосфатмобилизующей культуры В. subtilis 5, значительно повысила количество нормально сформировавшихся проростков, а также энергию прорастания [Курдиш и др., 2001].

Сообщается, что внесение азотобактера с семенами сахарной свеклы способствовало повышению урожая и значительному накоплению общего и гидролизуемого азота; прибавка общего азота в ризосферной почве достигала 200 мг/кг почвы [Доросинский, 1965]. В Югославии было изучено влияние бактеризации семян штаммами Az. chroococcum и Az. lipoferum на урожай и качество сахарной свеклы. Показано, что эффективность бактеризации семян зависит от вида и штамма азотфиксирующих бактерий и сортовых особенностей сахарной свеклы [Govedrica et al., 1999; Mrkovacki et al., 2002]. Применение азотобактера позволило повысить урожайность сахарной свеклы до 590 ц/га, а выход саха-

pa - до 100 ц/га. Применение бактериальных удобрений снижало содержание натрия и аминного азота, что способствовало повышению качества сахарной свеклы [Govedrica et al., 1999; Mrkovacki et al., 2001]. Бактеризация семян сахарной свеклы Az. chroococcum шт. 20, 77 и Az. vinelandii пгг. 56 способствовала повышению азотфиксации в ризосфере, увеличению содержания витаминов группы В в сахарной свекле, значительному увеличению урожая и снижению развития грибных инфекций, причем обработка штаммом Az. vinelandii имела лучшие результаты по всем показателям [Антипчук и др., 1997].

Ряд исследователей сообщает о влиянии свободноживущих азотфиксаторов на формирование и функционирование бобово- ризобиальных симбиозов; так, отмечено, что диазотрофы могут как значительно стимулировать развитие клубеньковых бактерий, так и отрицательно влиять на симбиотическую систему ри- зобий, конкурируя за питание [Надкерничная, Ковалевская, 2001]. Диазотрофы родов Enterobacter и Pseudomonas усиливали рост корневой системы растений клевера с увеличением азотфиксации на 40% по сравнению с применением только ризобий, но не увеличивали массу надземной части; бактерии р. Azotobacter не оказывали влияния на симбиоз клевера с ризобиями, а Azospirillum угнетали данный симбиоз. При комплексной инокуляции сои азотобактером и клубеньковыми бактериями наблюдалось увеличение массы сухой надземной части, в варианте с использованием Az. brasilense и Pseudomonas sp. увеличивалось количество клубеньков на корнях растений, при использовании бактерий рода Enterobacter возрастали оба показателя. Поэтому эффективность комплексной бактеризации диазотрофами и клубеньковыми бактериями зависит от индивидуального подбора макро- и микросимбионтов [Надкерничная, Ковалевская, 2001]. Показана возможность создания комплексных препаратов на основе ассоциаций ризобий с диазотрофами родов Klebsiella, Enterobacter и фосфатмобилизующими гетеротрофами родов Streptococcus и Bacillus, эффективность которых на 14% на клевере и на 28% на горохе выше, чем моноризобиальных инокулянтов [Суховицкая и др., 2002]. Биопрепараты на основе диазотрофных бактерий повышали продуктивность сои и симбиотическую азот- фиксацию, лучшие результаты получены при использовании флавобактерина (Flavobacterium sp. шт. Л30), ризоагрина (Agrobacterium radiobacter шт. 204) и агрофила (Agrobacterium radiobacter шт. 10) [Толкачев, 1997]. Сообщается, что инокуляция посевного материала бобов азотобактером повысила урожай и симбиотическую азотфиксацию [Kucharski et al., 1997]. Значительный стимулирующий эффект для сои, который выражался в увеличении количества и массы клубеньков и массы надземной части (22-105%), был получен при использовани бактериальных бинарных композиций штаммов Bradyrhizobium japonicum со штаммами Bacillus subtilis, В. megaterium, Az. chroococcum и Az. vinelandii. В случае композиции штаммов В. japonicum 10к и Az. vinelandii 56 наблюдалось увеличение числа клубеньков и их массы, а при использовании штамма В. japonicum 6346 была отмечена высокая нитрогеназная активность в расчете на 1 растение сои [Мельникова и др., 2002].

Существуют попытки формирования искусственных азотфи- ксирующих симбиозов; так, были получены псевдоклубеньки на корнях рапса, выращенного в нестерильной почве при одновременном воздействии на растительные клетки нодулирующих агентов: ауксиноподобного вещества и азотфиксирующей ассоциации, состоящей из Azotobacter nigricans и Baccilus sp. Азотфи- ксирующая активность нодулированных растений в 2 раза выше, чем у инокулированных растений без псевдоклубеньков, и в 5 раз выше, чем в неинокулированном контроле. Формирование псевдоклубеньков повышало продуктивность растений на 40% относительно контроля и обеспечивало достоверный прирост содержания общего и белкового азота в растениях [Ковальская, 2000; Ковальская и др., 2001].

В последнее время все большее внимание уделяется ассоциативной азотфиксации. Азотфиксирующие микробные ассоциации, природные [Злотников и др., 1990] и искусственно созданные [Умаров и др., 1993; Шабаев и др., 1995; Казанцева, Ашмарина, 1999; Меуег, 1986; Liste, 1993], характеризуются повышенной эффективностью действия на растение по сравнению с чистыми культурами диазотрофов.

А.К. Злотников и др. [1990] проводили эксперименты с бинарными культурами диазотрофных бактерий, обладающих ярко выраженным “ассоциативным эффектом”: нитрогеназная активность ассоциаций превышала сумму слагающих их компонентов в 2-10 раз. Было установлено, что активность азотфиксации смешанных культур имеет четко выраженный максимум при строго определенном соотношении компонентов, индивидуальном для каждой ассоциации.

Отмечено положительное влияние совместной инокуляции сои клубеньковыми бактериями Bradyrhizobium japonicum 110 и бактериями Р. fluorescens 20 по сравнению с применением одних клубеньковых бактерий [Шабаев и др., 1995]. Под влиянием двойной инокуляции сои увеличивались масса корневых клубеньков и количество “биологического” азота в растениях, вынос азота растениями и масса зерна сои.

В модельном вегетационном опыте внесение в почву Р. puti- da с эндомикоризными грибами стимулировало образование клубеньков и повысило массу клевера [Meyer, Linderman, 1986]. Применение смешанных культур клубеньковых бактерий с бактериями р. Pseudomonas, наряду с усилением клубенькробразо- вания, улучшило азотное питание и повысило урожай люцерны [Liste, 1993]. В результате предпосевой обработки семян сои бактериями родов Pseudomonas и Rhizobium отмечено усиление активности азотфиксации и повышение продуктивности растений на 29-33% по сравнению с контролем [Казанцева, Ашмарина, 1999].

Е.В. Надкерничная и Т.М. Ковалевская [2001] в своей работе отмечают, что комплексная бактеризация бобовых растений сво- бодноживущими азотфиксаторами и клубеньковыми бактериями не всегда дает положительный эффект. Так, например, совместная инокуляция люпина желтого ризобиями и Pseudomonas sp. 1140 незначительно повлияла на увеличение массы сухой надземной части растений, на количество клубеньков, но нитрогеназная активность оказалась в 1,8 раза слабее, чем при использовании только клубеньковых бактерий.

Еще один механизм положительного влияния ризобактерий р. Pseudomonas на растения - это мобилизация труднодоступных питательных веществ почвы [Алексеева, 1982; Пат. 1805849]. Лабораторными экспериментами подтверждено, что некоторые штаммы псевдомонад участвуют в превращении органических и минеральных фосфатов почвы в соединения фосфора, доступные для растений [Сидоренко, 2001]. К сожалению, исследованию возможности использования штаммов р. Pseudomonas для улучшения фосфорного питания растений не уделяется достаточного внимания.

Таким образом, доказано, что способы положительного воздействия псевдомонад на растения весьма разнообразны: защита от патогенов за счет синтеза антибиотиков, сидерофоров, экзоферментов; синтез фитогормонов, фиксация молекулярного азота, мобилизация труднодоступных питательных веществ почвы. К сожалению, в большинстве работ авторы акцентируют внимание на каком-либо одном из механизмов биологического контроля, тогда как в естественных условиях супрессирующее влияние псевдомонад на фитопатогены всегда определяется комплексным действием ряда факторов. Поэтому, на наш взгляд, если речь идет о PGPR-микроорганизмах, необходимо давать суммарную характеристику их полезных свойств с антимикробным и ростстимулирующим эффектом.