ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА BIRNAVIRIDAE

Бирнавирусы (от англ. bi-двойной, гпа - рибонуклеиновая кислота) - небольшая группа вирусов, поражающая позвоночных, беспозвоночных и насекомых. Вирионы бирнавирусов представляют собой сферические частицы диаметром 60 нм.

Семейство Birnaviridae состоит из 3-х родов: Aquabirnavirus (вирус инфекционного некроза поджелудочной железы рыб, Avibirnavirus (вирус ИББ) и Entomobirnavirus (вирус X дрозофилы).

ИНФЕКЦИОННЫЙ БУРСИТ КУР

Gumboro disease of poul try (IBR), Infecrions bursal disease (англ.); Cumboro- Krank heit, Ansteckende Bursa - Krankheit (нем.); Bursitis Infectiosa Calinae (лат.)

Инфекционный бурсит ИБ, болезнь Гамборо БГ; инфекционная бурсальная болезнь ИББ -

остро протекающая, контагиозная болезнь, поражающая чаще всего цыплят 2-15-нед возраста. Проявляется диареей, апатией, отсутствием аппетита, иногда дрожью, вторичным нефрозом, поражением фабрициевой бурсы, внутримышечными геморрагиями. Впервые болезнь зарегистрировали в 1957 г. в местечке Гамборо (США) на ряде птицеферм как контагиозную болезнь цыплят неизвестной этиологии с признаками поражения почек и фабрициевой сумки.

Болезнь зарегистрирована во всех странах мира. Данные серологического исследования показывают, что зараженность стад колеблется от 2 до 100%. ИБ распространен преимущественно в птицеводческих хозяйствах промышленного направления. Причиной этого считают постоянный импорт птицы.

Клинические признаки и патологоанатомические изменения. Поражаются цыплята 3-6-нед возраста, болезнь у них протекает остро; а также цыплята моложе 3-х нед, не содержащие материнских АТ. Такая ранняя инфекция приводит к иммунодепрессии и повы- Глава 2. Family Birnaviridae Бирнавирусные инфекции шению чувствительности к секундарной инфекции. В крови больных птиц увеличивается уровень мочевой кислоты и даже появляются кристаллические ураты в почках. Почечная ткань дегенерирует с образованием лимфоидных скоплений. Вероятно, поражение почек связано с появлением иммунных комплексов. Фабрициева сумка и селезенка подвергаются лимфоидному некрозу. Инкубационный период болезни очень короткий. При экспериментальном заражении гистологические признаки повреждения бурсы обнаруживают уже через 24 ч, а клинические - через 2-3 дня. Болезнь длится 5-7 дн (Рис. 13). Она может протекать подостро и латентно в зависимости от иммунного состояния поголовья. В чувствительных к стадах кур она появляется внезапно, уровень заболеваемости нередко достигает 100%.

Один из первых симптомов ИБ - днарея, сопровождающаяся выделением водянистого беловато-желтого помета. У больных цыплят наблюдают депрессию, а затем (в более поздней стадии) - сенсорные нарушения: дрожание головы, шеи и затем глубокая прострация. Заболеваемость и смертность нарастают быстро и достигают максимума на 3-4-й день болезни, далее, в течение 5-7 дн она обычно идет на убыль. Отличительные признаки болезни - внезапность и высокий уровень поражения, зубчатая кривая смертности и быстрое выздоровление (Рис. 15). Уровень смертности составляет 6%, но может достигать 20-37,6%. У цыплят-бройлеров ИБ выявляется в раннем возрасте (2-8 нед). Птицы яйценоских пород более чувствительны к заражению, чем бройлеры. При заболевании их смертность составляет 5-

15% (72). Наибольшие экономические потери вызывает субклиническая инфекция у бройлеров моложе 4-х нед. Она выражается, главным образом, в замедлении роста. При заболевании взрослой птицы наблюдается лишь некоторое снижение процента жизнеспособности эмбрионов. Вирус проникает через пищеварительный тракт и через 24-48 ч обнаруживается в фабрициевой сумке, где на 12-15-й день эмбриональной жизни образуются В- лимфоциты (58).Иммунодепрессивное действие вируса проявляется снижением уровня сывороточного комплемента и нарушением системы свертывания крови. В последние годы заметно увеличилось число вспышек ИБ, протекающего субклинически. При этом, раннее инфицирование приведет к угнетению иммунитета, что способствует возникновению сопутствующих инфекционных болезней. Развитие хронических респираторных болезней на фоне ИБ может приводить к появлению синдрома опухания головы. У таких птиц обнаруживают опухшие подглазничные синусы, экссудат в носовых полостях, трахее и легких. При вскрытии из пораженных тканей часто выделяют сапрофитную микрофлору, стафилококки, стрептококки, псевдомонады и др. ИБ обычно наблюдают у цыплят между 21-35 дн жизни, как правило, после вакцинации их против НБ и ИБК. Помимо того, причиной различного проявления болезни могут быть различные варианты самого вируса (66а, 66Ь).

Патологоанатомические изменения при первых вспышках болезни обычно наиболее яркие. В последующих выводах подобные вспышки среди цыплят повторяются время от времени, протекая менее тяжело и часто проходят незамеченными. Трупы цыплят хорошо упитаны, однако мышцы их обезвожены и бледны, зоб пустой. В грудных мышцах, особенно, с медиальной стороны бедер и крыльев, встречаются точечные и пятнистые кровоизлияния, реже - на серозных покровах органов грудобрюшной полости. При экспериментальной инфекции кровоизлияния обнаруживаются только у 1% птиц. Печень резко увеличена, на поверхности ее видны следы от ребер. Почки набухшие, увеличены, от светло-серого до темно- коричневого цвета, с четким рисунком заполненных уратами канальцев и мочеточников. Изменения почек встречаются непостоянно, при экспериментальной инфекции их обнаруживают примерно у 5% птиц. Кроме того, отмечают увеличение селезенки, катаральный энтерит, геморрагии слизистой оболочки железистого желудка и в миндалинах слепой кишки.

Фабрициева сумка является мишенью для вируса. Макро- и микроскопические изменения в ней после заражения 1-сут цыплят появляются в 5-дн возрасте. Ярко выражены и весьма закономерны поражения бурсы, которые обнаруживаются даже в случаях бессим-

Глава 2. Family Birnaviridae Бирнавирусные инфекции птомной инфекции. Бурса увеличена в 3-4 раза и более. У экспериментально зараженных бройлеров выявлены неоднотипные патоморфологические изменения в различные сроки после заражения. Увеличение бурсы наблюдали через 36 ч после инфекции, наибольшей величины она достигала через 48 ч, а спустя 33 дня - в 3-4 раза была меньше, чем у контрольных птиц. Серозная оболочка желтоватого цвета, с заметной полосатостью. Слизистая отечная, покрасневшая, иногда пронизана петехиями. В просвете между складками бывает заметен экссудат с хлопьями фибрина, в тяжелых случаях - кровянистая жидкость или сыроподобные фибринозные слепки. При вскрытии у птиц находят красноватые эрозии предже- лудка, гепатит с обесцвечиванием печени, нефрит без гипертрофии почек, атрофированную селезенку, петехии в фабрициевой бурсе, но без гипертрофии, геморрагии и петехии в грудных мышцах и часто в мышцах ног, серозный перикардит, гипертрофию бурсы.

Патогенез. Микроскопические изменения, характерные для ИБ, находят в фабрициевой сумке больных птиц. В основном они характеризуются некрозом лимфоидных и гиперплазией ретикулоэндотелиальных клеток, активизацией и пролиферацией кортикомедуллярного эпителия, формирующего на месте фолликулов железы, подобные кишечным; утолщением межфолликуляриых соединительных перегородок. Патогенез ИБ заключается в поражении лимфоидных тканей, причем в первую очередь разрушаются лимфоциты фабрициевой сумки, селезенки, цекальных желез слепых отростков и др. Он зависит от влияния иммунных комплексов циркулирующих инфицированных лимфоцитов. Наиболее чувствительны к вирусу лимфоциты, на поверхности которых фиксируются IgM. Поэтому основная мишень для вируса - подкласс В-лимфоцитов. Кровоизлияния в фабрициевой сумке, грудных и бедренных мышцах обусловлены участием комплемента. Вирус проникает через пищеварительный тракт и спустя 24-48 ч локализуется в фабрициевой сумке.

Изучены детально патоморфологические аспекты ИБ птиц (36). Инфицированные клетки бурсы резко отличаются от интактных. Ядра смещаются к периферии клетки, гетерохроматин конденсируется около кариолеммы, поэтому кариоплазма просветляется. Митохондрии увеличиваются до 1-1,2 мкм, крипты разрушаются, матрикс становится электронно- прозрачным. Цистерны эндоплазматической сети расширяются до 100-130 нм. Аппарат Гольджи гипертрофирован, появлялись многочисленные вакуоли диаметром 1-1,5 мкм с электроннопрозрачным или гомогенным электронноплотным содержимым, в последнем случае связанным со стенками вакуолей рыхлым материалом в виде тяжей, а сами вакуоли чаще всего имели вытянутую, каплевидную и реже округлую форму. Конечной стадией формирования вирионов, по-видимому, является их агрегация в виде паракристаллических скоплений диаметром 2-3 мкм в практически полностью разрушенной клетке (18,36).

Патогенез болезни зависит от воздействия иммунных комплексов циркулирующих инфицированных лимфоцитов. Наличие гемморагических поражений в скелетных мышцах, печени и других органах обусловлено участием в этих процессах комплемента. Присутствие уратов в почках и увеличение содержания в крови мочевой кислоты свидетельствуют о поражении почек. Повышение в крови лактатдегидрогеназы и глутаматоксолаттрансминазы подтверждает поражение печени. Патоморфологические изменения бурсы патогномоничны для болезни. В цитоплазме гистиоцитов и макрофагов обнаруживали скопления вирусных частиц размером 50-70 нм. Гематологические изменения характризуются лимфопенией и эритроцитозом. За 2 дня болезни снижается общее количество лейкоцитов, на 5-й день оно возрастает и достигает максимума на 7-й день после заражения. Перед смертью цыплят содержание лейкоцитов достигало 70%, половина из них были крупные недоразвитые клетки. Установлена связь между возрастом цыплят и нарушением свертываемости крови. Высоко Глава 2. Family Birnaviridae Бирнавирусные инфекции чувствительными к вирусу оказались лимфоциты, несущие на поверхности IgM. Эта подгруппа В-лимфоцитов и является мишенью. Вирус проявляет иммунодепрессивный эффект, поражает преимущественно незрелые В-лимфоциты (61).

У заболевшей птицы ослаблен иммунный ответ на вакцинацию и повышена чувствительность к интеркурентным заболеваниям в т.ч. БМ, НБ, ИБ и ЛТ (50). Вирус ИБ может повышать чувствительность цыплят к кишечной палочке и оба агента вызывают развитие у цыплят сходных дегенеративных изменений в фабрициевой бурсе и тимусе (34, 7). Первичная атрофия бурсы сопровождается пролиферацией кортико-медулярного эпителия и образованием слизи в секреторных железах. Диарея при ИБ развивается в следствие репликации вируса в энтероцитах крнпт, что ведет к нарушению функции кишечника, его секреторной деятельности и обезвоживанию организма. Развитие нефроза связывают с развитием комплекса АГ-АТ, который разрушает эндотелий извитых канальцев и почечных клубочков. В результате нарушается функция почек, что вызывает интенсивное отложение уратов. Однако поражение почек не следует считать патогномоничным признаком для ИБ (66). Цыплята, инфицированные вирусом ИБ в суточном и в 7-дн возрасте E.coly (вирус + высоковирулен- тая E.coli), погибали в 90% случаев при развитии тяжелой формы болезни, тогда как моноинфекция E.Coli индуцировала только 40%-ную летальность. Слабовирулентный шт. E.coli вызывал 10%-ную гибель. Однако, при сочетанной инфекции погибало 50% цыплят (66).

ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

Вирус впервые описан в 1962 г. в районе Гамборо штате Делавер, США. Вначале заболевание характеризовалось как птичий нефроз. Год спустя аналогичное заболевание было зарегистрировано в Австралии как “уремия”. В 1962 г. вирус был выделен на КЭ (87), а заболевание назвали “инфекционной бурсальной болезнью”. Позднее заболевание с почечным синдромом было отнесено к инфекционному бронхиту, а заболевание с поражением бурсы Фабрициуса - к инфекционной бурсальной болезни.

Морфология и химический состав. Вирионы имеют форму 20-гранника, капсид состоит из 32 капсомеров, внрион безоболочечный, 55 нм в диаметре. У вируса установлена 2- спиральная РНК (59). Обнаружено 2 типа частиц вируса: большие - 55-60 нм и маленькие - 18-22 нм при наличии одного поверхностного АГ. Вирус имеет 2 сегмента геномной РНК - А и В. Сегмент А кодирует полипротеин 110 кД, который превращается в вирусные белки VP2, VP3, VP4 и VP5 (57). РНК вируса в градиенте сахарозы седиментирует одним пиком с коэффициентом 14S, что соответствует мол.м. 2,2-106 Д. Плавучая плотность ее в CsCl 1,62 г/см3, в градиенте сахарозы - 1,178 г/см3. Вирусная РНК на 95% устойчива к действию РНК- азы А. Температура плавления ее в присутствии 1% формальдегида в стандартном буфере составляет 95,5°С. При электрофорезе в 7,5% ПААГ препараты вирусной РНК разделены на 2 фракции. Геном вируса ИБ представлен 2-мя сегментами 2-спиральной РНК с мол.м. 2,5-105 и 2,2105 Д. Из вирионов получено 5 полипептидов: VP1 (90000), VP2 (41000), VP3 (35000), VP4 (28000) и VP5 (17, 37, 62).

Белок VP3 обладает высокой иммуногенностью, он имеет эпитопы, индуцирующие синтез ВНА. Из вируса выделен один из главных структурных белков VP2b и VP2a. Конфор- мационный эпитоп белка VP 2а/2Ь - один из главных субъединиц вируса ИБ типа I, ответственных за иммуногенность (43,44). Замена одной аминокислоты в области, кодирующей АГ структуру, ответственную за индукцию ВНА, ведет к нарушению нейтрализующих свойств.

Методом ПЦР амплифицированы вариабильные участки кДНК гена VP2 5-и штаммов вируса ИБ. Определена последовательность нуклеотидов и рассчитана последовательность аминокислот. Установлена тесная связь между 2-мя вакцинными iiit.GLS и Var-r (37а). Определена также первичная структура фрагмента области основной АГ-детерминанты структурного гена VP2, 6-и вариантов вакцинных штаммов и проведен их сравнительный анализ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что выбор вакцинного штамма вируса ИБ

Глава 2. Family Birnaviridae Бирнавирусные инфекции должен проводиться с учетом АГ структуры эпизоотического штамма. Целесообразно использовать вакцинный штамм, обладающий наибольшей степенью гомологии в области АГ- детерминанты с эпизоотическим штаммов вируса ИБ (27а). Существует корреляция между АГ-свойствами и последовательностями нуклеотидов и аминокислот области сегмента А генома вируса, кодирующего VP2 (70а).

Устойчивость. Вирус резистентен к эфиру, хлороформу и изменению pH (2-11). Инактивируется при pH 12. Сохраняет активность при 56°С 5 ч, при 60°С 30 мин, а при 30°С в сухом помещении 150-180 дн; в присутствии 0,5%-ного фенола или 0,125%-ного мертио- лята 1 ч. При воздействии 0,5%-ного формалина инактивируется за 6 ч, препаратами йода - за 2 мин при 23 °С, 0,5%-ным хлорамином - за 10 мин. Устойчив к фотодинамии и УФ- облучению, чувствителен к акгиномицину Д.

Антигенная структура, вариабельность и родство. В структуре вируса обнаружено 5 белков. В структуре вириона выявлены белки VP1, VP2b (происходящий из VP2), VP2a предшественник протеина VP2 и VP3 (17). Протеин VP2 ответственен за индукцию ВНА и типоспецифичность, а группоспецифичность обеспечивается белком VP3. Серотип I, выделенный от цыплят и патогенный для них, насчитывает 6 подтипов. Серотип II, изолированный от индеек, не патогенен для цыплят и индюшат, однако в отдельных случаях вызывает поражение респираторного тракта и суставов у индюшек до 16-нед возраста.

АГ отличающиеся штаммы одни авторы рассматривают как штаммы серотипа I, а другие - как его подтипы, полагая, что существенные различия связаны с генетической реассор- тацией или точечными мутациями. Такие изоляты вируса могут появляться в результате селекции, связанной, в основном, с иммунным статусом птицы. Феномен такого рода присущ и другим вирусам с сегментированным геномом. Привлекательно предположение о том, что новые штаммы могут быть производными широко применяемых ранее живых вирус-вакцин против ИБ. МонАТ, полученные на АГ, индуцирующий образование ВНА, или его детерминанты, позволяют проводить тестирование и идентификацию вновь выделенных изолятов. С их помощью можно детально изучать эволюцию и географическое распространение вируса ИБ и различных штаммов. АГ-родство 2-х серотипов вируса ИБ (Си-1 от цыплят и 23/82 от индюшат) не превышало 10-30%, поэтому перекрестный иммунитет минимальный. В 1986 г. идентифицировано уже 3 серотипа вируса. Вирус 1-го серотипа содержит белки VP1, VP2, VP3 и VP4, а также белок VPx, который является предшественником VP2. У вируса 2- го серотипа обнаружены белки, соответствующие VP1, VP2, VP3 и VP4. В Англии в подавляющем большинстве стад кур АТ обнаружены одновременно к обоим серотипам. Между вирусами 2-х серотипов существует лишь небольшое АГ-родство.

У индеек установлено 2 серотипа вируса ИБ. К 1-му были отнесены шт. AFL, ВВ, LyN и NC, ко 2-му - МО и ОН (49). У них не обнаружены АТ к 1-му серотипу вируса ИБ (41).

Множество АГ вариантов вируса ИБ делится серологическими методами на несколько групп: гомология меньше 10% - различия в серотипе, гомология 10-32% - большой подтип, гомология 33-70% - малый подтип, гомология 71-100% - слабое различие или его отсутствие. Все штаммы данного вируса иммуносупрессивны. Смертность и иммуносупрессия связаны со стандартными и высоковирулентными штаммами 1-го серотипа. До 1980 г. преобладала циркуляция стандартного вируса, позже - его варианты (53).

Серотип I представлен 2-мя вариантами - VA и IM. Некроз тканей фабрициевой сумки, вызванный изолятом IM, сопровождается воспалительной реакцией, тогда как у птиц, зараженных вариантом VA, воспалительная реакция была сглаженной. Кроме того, изолят IM индуцировал более сильные изменения в тимусе по сравнению с изолятом VA. Указанные варианты вируса патогенны и не нейтрализовались полностью АТ против вируса серотипа I. Следовательно, вакцинация цыплят серотипом I не снимает возможную иммунодепрессию и экономические потери при инфицировании серологически отличными вариантами (79). Недавно в хозяйствах США был выделен новый АГ вариант вируса ИБ, который не реагировал с монАТ против ранее известных штаммов, включая вакцинные (R63 и В69), однако взаимодействовал с полиАТ. Авторы рекомендовали выделенный штамм для изготовления инактивированных и живых вакцин (76). Изоляты, выделенные в штате Джорджия США U28 и 3212 различались по АГ сайтам, биологическим свойствам, патогенности и степени поражения фабрициевой сумки. Атрофию вызывает больше изолят U28 (71,74).

В России изучена АГ вариабельность 6 вакцинных штаммов вируса ИБ с целью их эффективного применения: Gumboral СТ, Bur 706 (Франция), Taviar IBD (Италия), Gumbophyl (Венгрия), D78 (Голландия), БГ (Россия). Структурный ген VP2 (444 нуклеотида, что соотвтствует 148 аминокислотам) кэпирован в состав плазмиды рИС-19. Вакцинные штаммы подразделяются на 2 группы, которые существенно отличались друг от друга (8% аминокислотных замен). Как видно из приведённых примеров выбор вакцинного штамма вируса ИБ должен проводиться с учетом АГ структуры эпизоотического штамма. Целесообразно использовать вакцинный штамм, обладающий наибольшей степенью гомологии в области АГ-детерминанты с эпизоотическим штаммом вируса ИБ (27). АГ вариабельность штаммов, изолированных в России, изучена методом прямого секвенирования. Определена нуклеотидная последовательность детерминанты структурного гена VP2. Установлено, что значительная часть изолятов (8) образует относительно гомогенную группу (не более 1,5% нуклеотидных и 1% аминокислотных замен). Остальные 5 изолятов имели более существенные отличия (от 2 до 7% нуклеотидных и от 1,2 до 5,2% аминокислотных замен).

Локализация вируса. На 3-й день после экспериментального заражения 4-4,5-нед цыплят вирус в высоких концентрациях накапливается в фабрициевой сумке и селезенке, и в более низких концентрациях - в мозге и крови. Из бурсальной ткани его выделяли до 14-го дня после заражения, в ИФ - до 5-6-го, в ИД - до 3-4-го дня. У 1-дн цыплят через 3 дня после введения вируса отмечена высокая концентрация его в фабрициевой сумке, печени и почках. Вирус хорошо реплицируется в макрофагах и несколько хуже - в ретикулярных клетках, гетерофилах, эпителиальных клетках. Недавно было показано, что вирус размножается в лимфоцитах. Лимфолитические явления наблюдались через 8 ч после заражения. В цитоплазме макрофагов находили сферические и гексагональные вирусные частицы. Последние обнаруживали в цитоплазме макрофагов, лимфоцитов и ретикулярных эпителиальных клетках единичными или множественными пластами (69, 70).

При экспериментальном заражении вирус удавалось выделять в течение 10 дн, однако патологические изменения в фабрициевой сумке сохранялись до 10 нед после заражения. Это указывает на малую вероятность носительства вируса ИБ, кратковременность его нахождения в крови и возможность длительного обнаружения поражений фабрициевой сумки.

Антигенная активность. Через 3 нед после заражения 3-6-нед цыплят вирусом в сыворотках крови обнаруживают ВНА (достигают титра 1:718) и ПА. К 14-му дню титр ПА достигал 1:128, и цыплята приобретали устойчивость к заражению патогенным вирусом. АТ у кур-несушек передаются потомству трансовариально. ПА в сыворотке крови появляются у птиц на 7-й, в фабрициевой сумке - на 12-й, в селезенке - на 15-й день цосле заражения. ВНА в индюшиных хозяйствах Германии устанавливали сразу после вылупления птенцов. Количество положительных сывороток к серотипу I варьировало от 65 до 80%, в других же хозяйствах количество положительных сывороток к серотипу II достигало 75-100% (67).

Экспериментальная инфекция. Воспроизводится на 20-30-дн цыплятах при инокуляции им вируссодержащего материала на слизистую оболочку глаз, в фабрициеву сумку или per os. Первые признаки болезни проявляются тремором головы и тела, а через 48 ч - диареей. На 3-й день фекалии становятся беловатыми и содержат слизь, но к 7-му дню болезни приобретают нормальный вид. На 3-4-й день после заражения у цыплят отмечали увеличение фабрициевой сумки в 1,5-2 раза и отек. Бурса мягкая, бугристая, содержала вязкий сли-

Глава 2. Family Birnaviridae Бирнавирусные инфекции зистый материал, внутренние складки воспалены и желтого цвета. На 22-23 сут после заражения фабрициева сумка обычно уменьшается, консистенция ее становится плотной и на разрезе гладкой, слизь отсутствует. В эпителиальных и ретикулярных клетках пораженных фолликулов обычно обнаруживались ацидофильные включения, окруженные светлым ареалом. Некротические участки фолликулов обильно заселены макрофагами. У части отмечают псевдокисты. Через 3-5 дн после заражения патологические изменения фабрициевой сумки были настолько выраженными, что болезнь диагностировалась без затруднения.

На 33, 51 и 71 дни после заражения можно наблюдать атрофию бурсы. У 1-3 сут белых мышей при интраперитонеальном и интрацеребральном их заражениях (шт. Becht) отмечали зуд, атаксию, дрожь, кому й негнойные лимфоцитарные воспаления мозговой ткани, сопровождавшиеся некрозом, демиелинизацией и скоплением лейкоцитов вокруг кровеносных сосудов. Крысы и хомяки также оказались чувствительными к интрацеребральному заражению. Индейки клинически не реагировали, но образовывали ПА и ВНА. Голуби, утки, гуси и перепела к экспериментальному заражению оказались резистентны (23). После ин- трабурсального заражения здоровых цыплят вирусный АГ в тканях фабрициевой сумки появлялся в 100% случаев через 12-14 ч и обнаруживался с помощью МФА и РДП (69). Утки чувствительны к вирусу ИБ серотипов I и II, но не проявляют клинических симптомов болезни, между тем серотип II широко распространен в природе (39). Патогенность вируса для утят сравнительно низкая, и переболевание сопровождается анорексией с небольшим подъемом температуры в течение 4-5 дн после заражения.

Культивирование. Вирус можно культивировать в КЭ, свободных от материнских АТ к ряду вирусных болезней, в том числе и к ИБ. Помимо эмбрионов вирус удается культивировать и на SPF-цыплятах. У инфицированных эмбрионов вирус накапливается в желточном мешке и в меньшей степени - в аллантоисной жидкости. Гибель КЭ наступает на 3-8-й день после заражения. У погибших отмечали отечность брюшной полости, кровоизлияния и некрозы на теле, некроз и кровоизлияния в печени, почках, гиперемию легких. На ХАО видимых поражений не развивается, лишь иногда обнаруживают небольшие кровоизлияния. Отмечены “бледное сердце”, гиперемия и некроз почек, гиперемия легких. Японские штаммы вируса размножаются в утиных эмбрионах (лучше при заражении на ХАО, чем в желточный мешок) и в культуре утиных фибробластов, но не в культуре клеток почки. Вирус хорошо репродуцируется в культуре почечных клеток КЭ, вызывая на 3-5-й день заражения ЦПД. Данная культура пригодна для титрования вируса, последовательные пассажи в ней не ведут к аттенуации вируса в отношении цыплят. В культуре фибробластов КЭ вирус образует бляшки (9, 28). В-клетки высокочувствительны к вирусу, а Т-клетки - нечувствительны. Установлено, что для выращивания вакцинного штамма БГ на перевиваемых культурах клеток необходимо предварительное пассирование его в КЭ или ККФ для D-78 - 1-2 пассажа, для Гумбофил - 2-3 пассажа. После этого (при инфекционной активности 104,15-10 5'5 ТЦД5о/ил) вакцинный вирус при оптимальных условиях в клетках Vero, RK-13, ВНК-21 репродуцировался в титрах Ю5’5-106,0 ТЦДго/мл, а в клетках CV-1 и CG-91 - 104,75-105’5. В отличие от вакцинного вирулентный вирус накапливался в более высоких титрах (28).

При инокуляции в аллантоисную полость вирус через 4 дн накапливается в титре 105 ЭИДзо/мл, а В культуре клеток утиных эмбрионов - 105 ТЦДзо/мл- В культуре клеток почек уток вирус не размножается. Показана возможность культивирования, типирования вируса ИБ и проведения PH в перевиваемой культуре клеток LSCE-BK3, МА-104, Vero, BGM-70 (23). Вирус ИБ более интенсивно размножается в линии промоноцитов IN24, чем в клетках линии ZSCC-NPJ (получена из клеток фабрициевой сумки курицы с лимфоидным лейкозом) (64). Вирус ИБ индеек адаптирован к первичной культуре фибробластов КЭ. На 5-й день клеточный монослой зараженной культуры полностью отделялся от стенок флаконов. Титр вируса на 3-й день достигал 106,3 ТЦ Д50/мл (16). Индюшиный шт. М-72 активно размножался

Глава 2. Family Birnaviridae Бирнавирусные инфекции в первичной культуре фибробластов и почек КЭ, а также перевиваемых линиях BGM-70 и Vero с образованием характерного для вируса ИБ ЦПЭ. ЦПЭ обычно проявлялся на 3-й день после инфицирования в виде грануляции клеток. При этом круглые и увеличенные в размере клетки располагались в монослое одиночно и в виде скоплений клеток (гроздей). Титр выделенного штамма в культуре клеток составлял на 4-й день после заражения 106’3 ТЦДзо/о,2 мл (16). Описано образование бляшек (шт. IPV) после 60 пассажей в ФЭК. Титрование вируса в ФЭК - более чувствительный метод, чем в организме новорожденных мышей. Телец-включений не находили. Вирус в культуре клеток КЭ формирует крупно- (диаметр 5 мм) и мелкобляшечные (диаметр 1 мм) клоны. Крупнобляшечные клоны обладали большей патогенностью, чем мелкобляшечные (73, 78).

Гемагглютинирующие свойства не установлены.

Различия в патогенности штаммов. Все классические вирусы ИБ, выделенные до 1985 г., имели сайт В 69, в то время как в вирионах (De Lavare, A, D, G и Е), выделенных в 1985 г., он отсутствовал (80). Для штаммов вируса ИБ характерна как высокая, так и умеренная патогенность. Они могут быть и апатогенными. Высоковирулентные штаммы ИБ вызывают острую форму заболевания с летальностью 30% и более. Слабовирулентные (умеренные) штаммы индуцируют инфекцию со стертыми клиническими и патологоанатомическими признаками при летальности в среднем до 5%. Апатогенные штаммы индуцируют субклиническое течение заболевания, точнее инаппарантную форму болезни, характерную для ряда вирусвакцин, применяемых против ИБ. Следовательно, при внедрении слабовирулентных и апатогенных штаммов может формироваться постинфекционный иммунитет, как при применении вакцин Bursin+, Bursin-2, 228Е и D-78 (17). О выделении природно ослабленного вируса ИБ впервые сообщили канадские исследователи (47а). В 1990 г. в Японии имела место среди кур эпизоотия ИБ с высокой летальностью. Изучено 29 штаммов вируса в РДП с использованием сыворотки к штамму вируса и АГ, приготовленных из тканей фабрициевой сумки инфицированных 5-6-нед цыплят. Удалось объединить изоляты в 3 группы. 1-я группа состояла из 16 штаммов, включая F539. К той же группе относился высокопатогенный шт. DV86, изолированный в 1986 г. в Голландии. Два штамма (группа 2) отличались как от F539, так и от G691. В 3-ю группу вошел G691 и 10 близких ему штаммов; они были изолированы до 1984 г. и обладали низкой патогенностью (81, 83).

У SPF-цыплят, предварительно вакцинированных живой вакциной, выделено 4 изолята вируса (A, D, G и Е). Изоляты отличались от классических штаммов тем, что очень быстро вызывали атрофию бурсы с минимальной воспалительной реакцией, незначительную смертность эмбрионов, но индуцируя у них некроз печени.

Интерфероногенные свойства. При заражении КЭ изолятом 2512 вируса ИБ наиболее высокая его концентрация через 26 ч была обнаружена непосредственно в эмбрионе, а минимальная - в аллантоисной жидкости. Начало образования интерферона отмечено через 48 ч после инокуляции, но в эмбрионе и ХАО титр его достигал максимума через 72 ч, а в аллантоисной жидкости - через 120 ч.

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

ИБ болеют цыплята всех пород с 2-15-нед возраста. Наиболее восприимчивы 3-6-нед цыплята породы белый леггорн. Сообщалось о самых ранних вспышках ИБ среди цыплят 11-дн возраста и самых поздних - в возрасте 84 дн. Заражение происходит при контакте здоровых цыплят с больными и через инфицированные корма, воду, инвентарь. Возможна передача вируса через яйцо и аэрогенно. Причиной поддержания инфекции в хозяйстве служит длительное (до 120 дн) выживание вируса в помещении. Инфицирование цыплят в раннем возрасте увеличивает процент заболеваемости и способствует более длительному периоду вирусовыделения после заражения. Наличие этого вируса в организме цыплят снижает иммунологический ответ на введение вакцинного вируса НБ. Спектр патогенности в естественных условиях. Куры всех пород - единственный вид, который поражается вирусом ИБ в естественных условиях. По-видимому, вследствие высокого тропизма вируса к слизистой оболочке фабрициевой сумки экспериментальное заражение птицы удается в период функционирования этого органа. При заражении взрослых кур-несушек, а также 1-14-дн цыплят не отмечено симптомов болезни. В 12 штатах США вирус изолирован от 6-нед индюшат и индеек, у которых была отмечена диарея; вирус оказался родственным референтному шт. ТВ89. Помимо кур и индюков вирус также выделен от летучих мышей и москитов. В последние годы его стали выделять и от уток. Впервые в нашей стране вирус выделен из гомогената фабрициевых сумок индюшат 24-37-сут возраста и идентифицирован как вирус ИБ индеек II серотипа (шт. М-92) (15,16 ).

Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции - больная птица. Возбудитель передается с корма ми, водой, инвентарем, через яйцо, аэрогенно и др. способами. Гельминтов и вшей считают прямыми векторами передачи. Дикие птицы могут быть прямыми и непрямыми векторами.

ДИАГНОСТИКА

ИБ трудно выявляемая инфекция, которая распространяется незаметно, маскируется другими болезнями и физиологическими нарушениями и лишь при типичном течении сравнительно легко диагностируется по клиническим и патологоанатомическим признакам. Внезапное появление болезни, сопровождающейся массовыми водянистыми поносами, высокой заболеваемостью, быстрым распространением и переболеванием в течение 5-7 дн и зубчатой кривой смертности, дают основание заподозрить наличие ИБ в хозяйстве. Подтверждением диагноза может быть обнаружение характерных изменений в фабрициевой сумке. На ранней стадии или при субклиническом течении необходимы лабораторные исследования.

Идентификацию вируса проводят с помощью PH и ИФА в модификации, соответствующей цели исследования и на соответствующих тест-системах. Наличие вируса в мазках из фабрициевой сумки определяют с помощью иммунопероксидазного окрашивания в присутствии авидин-биотинпероксидазного комплекса с использованием монАТ вирусу ВК70. Этот тест наиболее быстрый и высокоспецифичный.

Экспресс-диагностика. В настоящее время методы экспресс-диагностики детально не разработаны и не узаконены. Имеются сообщения о возможности применения в качестве таковых непрямого варианта ИФА (3, 4) и ИФ. Разработана схема постановки ПЦР, осуществлен подбор вирусспецифических праймеров. Метод ПЦР использован для выявления вируса ИБ в фабрициевых сумках инфицированных кур. Отработаны оптимальные условия амплификации фрагментов гена VP2, кодирующего структурный белок, ответственный за выработку ВНА против ИБ. Последующее секвенирование амплифицированных вирусспецифических фрагментов позволяет проводить идентификацию и дифференциацию вакцинных штаммов и полевых изолятов (27в).

Выделение вируса. Успех выделения вируса зависит от срока после заражения и возраста инфицированной птицы. Выделение вируса обычно успешно до 14 дн после заражения, а РДП и ИФ - до 3-5-го дня после заражения, эти реакции и более надежны, если ставятся с бурсальной тканью. Вирус ИБ обнаруживается в мышечном желудке, 12-перстной кишке и почках через 12 ч, а в селезенке и бурсе через 24 ч после заражения цыплят per os. Наилучшим сроком выделения вируса из пораженной бурсы является период - 4-8 дн. Главная система репликации вируса - это лимфоциты, макрофаги и ретикулярные клетки бурсы, а также лимфоидные клетки слепой кишки.

Взятие и подготовка материала. Для лабораторных исследований от павшей или убитой птицы берут фабрициеву сумку, печень, селезенку, почки. Пробы отбирают при появлении первых клинических признаков болезни (в течение первых 7 дн). Через неделю после начала болезни вирус практически выделить не удается. Материал пересылают в лаборато- Глава 2. Family Birnaviridae Бирнавирусные инфекции рию в термосе со льдом. Из кусочков патматериала готовят 10%-уею суспензию на изотоническом р-ре NaCl, центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость, после добавления антибиотиков (пенициллин 1000 ЕД/мл и стрептомицин 100 мг/мл), выдерживают в холодильнике при 4°С 6-12 ч и используют для заражения КЭ, культур клеток и восприимчивой птицы.

Заражение куриных эмбрионов. Используют 10-11-дн SPF-эмбрионы или эмбрионы из хозяйств, благополучных по инфекционным заболеваниям. КЭ заражают на ХАО общепринятым способом, инкубируют 10 дн, ежедневно овоскопируют. В первые 24 ч после заражения гибель их считается неспецифической. Погибшие КЭ вскрывают в день гибели после охлаждения при 4°С в течение 2-3 ч, а живые - на 10-й день инкубации, также после охлаждения. При наличии вируса КЭ гибнут на 3-7 день после заражения с характерными изменениями. На 3-й день после заражения отмечают гиперемию и точечные кровоизлияния на коже в области головы и конечностей, иногда незначительные утолщения и помутнение ХАО. На 4-5-й день появляются отеки подкожной клетчатки в области головы и брюшной стенки зародыша, многие эмбрионы отстают в развитии. Печень у них увеличена, желтоватого цвета, с зеленовато-белыми очажками различной формы на поверхности. Селезенка увеличена, бледная, с некротическими очажками величиной с просяное зерно. Сердечная мышца бледная, фабрициева сумка без видимых изменений.

Поскольку вирус ИБ не обладает Г A-свойствами, аллантоисную жидкость павших КЭ и с выраженной задержкой в росте проверяют на отсутствие гемагглютинации. Так как наибольшее накопление вируса в КЭ отмечается в ХАО и теле КЭ, особенно в печени, для пассажа отбирают ХАО и тело эмбриона (23).

Заражение культуры клеток. Для изоляции вируса используют 24-48-4 культуры ФЭК. Срок наступления ЦПД зависит от дозы вируса и числа пассажей. При первичном его выделении специфические изменения обычно наблюдаются после 2-3 пассажей вируссодержащего материала. ЦПД проявляется через 49-72 ч после инфицирования клеток и характеризуется образованием в монослое пустот, вакуолизацией и округлением клеток, в дальнейшем цитолизом и пикнозом ядер, образованием клеточных конгломератов, соединенных цитоплазматическими тяжами. Специфичность ЦПИ подтверждается заражением КЭ и постановкой PH. Рекомендуется использовать для этого линию клеток Лейкозных опухолей - LSCE-BK3. Изоляты вируса в культуре ФЭК или клетках почки цыплят обычно проверяют по следующим параметрам: ЦПД, терморезистентность, устойчивость к хлороформу, тип нуклеиновой кислоты, отсутствие внутриклеточных включений, отрицательная гемагглюти- нация, АГ тождественность референтным штаммам вируса

Заражение цыплят. Биопробу на цыплятах ставят с целью выделения вируса, изучения его патогенности, а также экспериментального воспроизведения заболевания. Заражают цыплят 21-25-дн возраста, не имеющих АТ к вирусу. Исследуемый материал вводят интрана- зально в дозе 0,5 мл, на конъюнктиву, в фабрициеву сумку или per os 10-15 цыплятам, за которыми наблюдают 15 дн. Результаты оценивают учитывая клиническое проявление болезни, патологоанатомические изменения, наличие специфических АТ в сыворотке крови. Наиболее восприимчивы к вирусу ИБ SPF-цыплята 20-сут возраста и 40-сут цыплята из промышленных интактных к ИБ стад. Установлено, что взрослые SPF-куры болеют ИБ, хотя клинические признаки у них менее выражены. Для биопробы используют гомогенезиро- ванную ткань бурсы Фабрициуса. Клинические симптомы появляются на 3-й день, а на 4-й наблюдается обширное поражение бурсы. Поражение бурсы проявляется через 1 сут после заражения и характеризуется исчезновением небольших зон лимфоцитов, которые составляют сетчатую структуру фолликулов. Через 1-5 дн после заражения появляются гетерофилы, пикнотический дебрис и множество ретикулярных клеток, заменяющих новые быстро исчезающие лимфоциты. В селезенке наблюдается гиперплазия ретикулоэндотелиальных клеток. В миндалинах слепой кишки отсутствуют фолликулы и лимфоциты. В почках появ-

Глава 2. Family Birnaviridae Бирнавирусные инфекции ляются большие цилиндры гомогенного инфильтрированного материала. При инокуляции слабовирулентного вируса ИБ симптомы болезни и видимые, патологоанатомические изменения в органах и тканях могут и не развиваться. В этом случае результаты биопробы оценивают по обнаружению вирусспецифического АГ и АТ в PH и РДП.

Индикация и идентификация вируса

Вирусоскопия, электронная и иммуноэлектронная микроскопия. Разработан точечный иммуноблотинг для обнаружения с помощью 2-х монАТ вируса ИБ в материалах из зараженных клеточных культур и в образцах ткани селезенки кур. Предел чувствительности монАТ, как иммунологических зондов, составлял 48 нг АГ. МонАТ выявляли присутствие вирусного АГ в тканях бурсы и селезенки через 2 сут после заражения (56). Дот- блотгибридизацией вирусспецифической РНК вирусспецифический АГ выявлялся уже спустя сутки после заражения. Этот метод более чувствителен, чем методы ИФ и РДП (38).

ИФ. Рекомендуется как дополнительный метод экспресс-диагностики, так как позволяет установить диагноз в течение 2-3 ч с момента доставки патматериала. С этой целью применяют прямой и непрямой варианты ИФ. Для ИФ из ткани фабрициевой сумки больной или павшей птицы готовят тонкие мазки-отпечатки (не менее трех) на обезжиренных предметных стеклах, высушивают на воздухе, фиксируют 10-20 мин в ацетоне, дважды отмывают в 2-

х сменах 0,01 М фосфатно-буферного р-ра, приготовленного на 0,15 М р-ре NaCl (pH 7,2-7,4), затем снова высушивают при комнатной температуре и окрашивают общепринятым методом. В качестве контроля используют препараты, приготовленные из фабрициевой сумки здоровых цыплят и аналогично обработанные. Диагноз считают положительным, если во всех 3-х препаратах обнаружено не менее 2-3 клеток со специфическим ярко-зеленым свечением АГ в цитоплазме (мелкие гранулы или диффузный ореол вокруг ядра). Ядерного свечения нет. Интенсивность и форма свечения вирусного АГ в клетке зависят от стадии развития болезни. Так, по данным А.С. Алиева (1-4), АГ выявлялся через 24 ч после инфицирования, значительное возрастание интенсивности свечения обнаружено с 3-го по 10-й день после заражения, а на 11-12-й день количество флюоресцирующих клеток уже снижалось, и на 13-й день они полностью отсутствовали. Помимо фабрициевой сумки специфическая ИФ отмечалась в цитоплазме лимфоидных клеток с 3-го по 5-й день после заражения. В препаратах из головного мозга, тимуса, легких, сердца, печени, почек и миндалин слепых отростков кишечника экспериментально зараженной птицы не удалось обнаружить АГ.

Кроме мазков-отпечатков для ИФ можно использовать и криосрезы из органов. Для этого пробы исследуемых тканей замораживают в петролейном эфире, охлажденном до -76°С в смеси ацетона и сухого льда, затем их примораживают к блоку микротома и переносят в криостат (-25°С). Срезы готовят толщиной не более 4-5 мкм. В сравнительных исследованиях мазков-отпечатков и криосрезов из фабрициевых сумок больных цыплят показано, что в гистосрезах была более отчетливая флюоресценция в цитоплазме и несколько слабее в ядрах клеток. Специфические сыворотки для ИФ получают на цыплятах-гнотобиотах 4-нед возраста путем окулярной инокуляции 104 ИД50 шт. ВАИ53 20-го пассажа. Сыворотки, обладающие высокой активностью и специфичностью в ИФ, были получены при иммунизации кур и кроликов концентрированным очищенным вирусом (степень очистки препарата составляла 99%) с титром 106’5 ЭИД50/0.2МЛ- Средний титр ВНА составил 5 lg, ПА - 1:32-1:64. Для конъюгации использовали сыворотки с показателями титра ПА не ниже 1:32.

PH. Это основной тест для идентификации вируса ИБ. В ней используют специфическую гипериммунную к вирусу и нормальную сыворотку, а в качестве АГ - выделенный на КЭ вирус. Перед постановкой реакции сыворотки инактивируют 30 мин при 58°С. PH ставят по общепринятой методике по варианту: постоянная доза сыворотки и различные разведения вируса. Гипериммунную и нормальную сыворотки разливают по 0,5 мл в стерильные пробирки. Затем в каждую из них добавляют по 0,5 мл вируса в разведении 10'5-10'9. Шта-

Глава 2. Family Birnaviridae Бирнавирусные инфекции тив с пробирками встряхивают и выдерживают при 37°С 30 мин или при 4°С 18-20 ч. Полученные смеси в дозе 0,2 м? вводят в аллантоисную полость 4-, 6- и 9 дн эмбрионов, которые затем инкубируют при 37°С. Дважды в день их овоскопируют и павших (после охлаждения) вскрывают. На 10-й день инкубации все эмбрионы вскрывают для выявления специфических изменений. Результаты выражают индексом нейтрализации (ИН), который определяют по общепринятой методике.

РДП. Широко применяют как с целью индикации и идентификации вируса, так и для обнаружения АТ. Реакция специфична, может проводиться в более ранние сроки, начиная с 8-го дня болезни. Предложен быстрый (в течение 45 мин) метод обнаружения в РДП специфических АТ в сыворотках крови птиц. В качестве АГ могут быть использованы фабри- циевы сумки зараженных цыплят. Считают, что концентрация преципитиногенов и положительно реагирующих проб значительно больше при использовании фабрициевых сумок, взятых через 3-4 дня после заражения цыплят. ХАО КЭ не пригодны для диагностики ИБ в РДП, т.к. не обладают преципитирующими свойствами. РДП ставят по общепринятой методике на предметных стеклах или в чашках Петри в 1%-м агаровом геле (32). Реакцию учитывают через 24-48 ч инкубирования при комнатной температуре. Чувствительность РДП связана с применением 0,01 М трис-HCl буфера (pH 7,3), АГ в исходной концентрации и иммунной сыворотки в рабочем разведении. Для ретроспективной диагностики исследуют в РДП сыворотки крови от суточных цыплят или от птиц старше 3-х мес (3, 4,12,13,14).

РНГА. Оказалась пригодной для диагностики ранней инфекции, а РТНГА - для индикации и идентификации вируса ИБ, выделенного на КЭ. Установлено, что сывороточные АТ, агглютинирующие сенсибилизированные эритроциты, выявляются у отдельных птиц уже на 3-5-й день после заражения в титрах 1:8-1:16, а к 2-3 нед после заражения - у 25-70% птиц в титрах 1:16-1:32. Титр АТ нарастал до 3-4-й нед, затем снижался до 1:2-1:4 (10).

ВНА получают на кроликах массой 2-3 кг по схеме: вируссодержащую аллантоисную жидкость вводят внутривенно 3 раза в неделю (через день) в течение 2 нед в дозах: в 1-ую неделю - по 3 мл, во 2-ую - по 5 мл. Через 7 дн после последней инъекции внутрибрюшинно вводят 10 мл вируса, а на следующие сутки внутривенно - 12 мл. Через 12 дн после последнего введения вируса кроликов обескровливают. Стерильные сыворотки расфасовывают по 1

мл и лиофилизируют. Активность и специфичность ее оценивают по ИН, который должен быть не ниже 100. ПА получают на 21-25-дн цыплятах, 1-кратно зараженных вируссодержащим центрифугатом внутрибрюшинно в объеме 2 мл. Через 7-14 дн после заражения у цыплят из подкрыльцовой вены берут кровь. При наличии ПА цыплят обескровливают и получают сыворотку. Цыплят, в крови которых не установлены ПА, дополнительно иммунизируют по следующей схеме: одновременно внутримышечно и внутривенно вводят по 3 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости, через 7 дн иммунизацию повторяют, а спустя 14 дн цыплят обескровливают. Стерильную сыворотку разливают по 1 мл, лиофилизируют. Активность и специфичность ее проверяют в РДП со специфическим АГ (26).

Серодиагностика и ретроспективная диагностика

Основывается на обнаружении ВНА и ПА в сыворотках крови больных и переболевших птиц. Выделение вируса из пораженных органов удается не всегда, поэтому лучшим методом диагностики ИБ является серодиагностика. Кроме того исследование сывороток проводят при бессимптомном течении болезни. Используют парные сыворотки крови, полученные от одних и тех же птиц (или от одной и той же группы птиц). Важное значение в профилактике ИБ имеет систематический контроль за иммунным состоянием стада. Такой контроль осуществляют посредством периодических исследований парных сывороток крови.

PH. В качестве АГ используют эталонный вирус ИБ. Исследуемые сыворотки и нормальную (контрольную) сыворотку перед постановкой реакции инактивируют при 58°С 30 мин. ВНА в сыворотке больных цыплят обнаруживаются, начиная с 13-го дня после зара-

Глава 2. Family Birnaviridae Бирнавирусные инфекции жения, их уровень зависит от возраста птицы, используемой для заражения. Так, у 4-нед цыплят уровень АТ выше (ИН 3,5 lg), чем у 3-нед (1,5-2 lg). Способность вырабатывать АТ после введения вируса у старших цыплят выражена сильнее, чем у молодых; АТ сохраняются в течение более 3 мес. ВНА обнаруживали через 3 дн в титре 1:8 у цыплят, зараженных вирусом Cu-IM. Титр АТ достигал максимального значения (1:8000) через 7 дн.

РДП ПА у птиц появлялись через 5 дн после экспериментального заражения и обнаруживались в течение 24 дн, по одним данным, и 70 дн, по другим, или всего периода яйцекладки. Интенсивность РДП зависит от сроков исследования после заражения: реакция проявляется слабо до 10-го дня после заражения, становится заметной к 20-му дню и держится более 20 нед. У цыплят, полученных от несушек, реагирующих интенсивно в РДП, ПА могут быть обнаружены до 5-6-дн возраста. Сыворотки с высокими титрами ВНА обычно бывают положительными и в РДП.

Установлена зависимость возраста птицы и титра АТ; так, у 1-2-нед цыплят установлены титры АТ 1:4 - 1:16, а у 3-нед - понижение до 1:2, у 4-6-нед - отсутствие АТ, что соответствовало морфологическим изменениям в исследуемых органах (фабрициева сумка, селезенка, зобная железа и миндалевидные железы слепой кишки). ПА у птиц образуются при естественном или искусственном заражении на 5-6-й день и сохраняются 2-3 мес, а ВНА чаще обнаруживают через 3 нед и сохраняются значительно дольше. Из этого следует, что отрицательный результат в РДП не говорит об отсутствии в сыворотке АТ к вирусу ИБ. Разработан быстрый количественный метод РДП для оценки титра АТ к вирусу ИБ с использованием 96-луночных панелей,а также метод обнаружения АТ в РДП в течение 45 мин.

Для приготовление антигена для РДП эталонным штаммом вируса заражают на ХАО 10-11-дн КЭ в дозе 0,2 мл. Через 72 ч инкубации КЭ охлаждают 4 ч при 4°С и вскрывают. ХАО собирают в отдельные пробирки. Вируссодержащие ХАО (каждую в отдельности) гомогенизируют 10 мин при 3000 мин'1, центрифугируют и надосадочную жидкость после проверки в РДП (с положительным результатом) с заведомо известной преципитирующей сывороткой используют в качестве АГ. Аналогично готовят и контрольный АГ из ХАО не- зараженных КЭ. Для получения АГ из фабрициевой сумки заражают интраназально 10-15 цыплят 20-25-дн возраста вируссодержащей аллантоисной жидкостью в дозе 0,5 мл. Через 72 ч цыплят с клиническими признаками болезни убивают, берут фабрициевы сумки, измельчают их и готовят 10%-ную суспензию на физиологическом р-ре, центрифугируют 15 мин при 3000 мин'1. Надосадочную жидкость после проверки в РДП используют в качестве АГ. Аналогично готовят контрольный АГ из фабрициевых сумок незараженных цыплят.

ELISA (ИФА). Для широкого серологического обследования применяют ИФА (ELI SA). Он позволяет раньше других тестов определять появление гуморальных АТ. Предложен кинетический Kits-ELISA для определения уровня АТ у птицы, иммунизированной против ИБ. Kits-ELISA позволяет на микропланшетах одновременно анализировать 60 образцов. Блокирующий вариант ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Чувствительность этого метода в 100 и более раз выше чувствительности РДП при выявлении АТ к вирусу ИБ. Его можно применять для серодиагностики вирусных инфекций и определения напряженности поствакцинального иммунитета. При исследовании сыворотки крови кур на наличие АТ в ИФА и РДП получены сопоставимые результаты, что позволяет рекомендовать ИФА для практического использования в диагностике ИБ. Детально отработана методика постановки непрямого варианта ИФА (12,19,20, 21).

Дифференциальная диагностика

ИБ необходимо дифференцировать от ИБК, НБ, БМ, лимфоидного лейкоза, саркомы Рауса, кокцидиоза, нефрозо-нефрита, аденовирусной апластической анемии, синдрома ожирения печени и почек, авитаминоза А, отравлений химическими иммунодепрессантами. При дифференциальной диагностике учитывают комплекс эпизоотологических, клинических, па-

Глава 2. Family Birnaviridae Бирнавирусные инфекции тологоанатомических, гистологических исследований и окончательно подтверждают вирусологическими и серологическими результатами. Доказано бессимптомное течение ИБ цыплят, которое удалось устанавливать с помощью гистологического и серологического исследований в первую неделю после вылупления.