ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА REOVIRIDAE

Семейство Reoviridae (от англ. respiratore enteric orphan) - большая группа вирусов, поражающая позвоночных, насекомых и растения.

Вирионы реовирусов представляют собой икосаэдрические частицы диаметром 60-80 нм и состоят из сердцевины и двойного капсида - наружного и внутреннего (Рис.

Геном реовирусов состоит из 10-12 уникальных фрагментов 2-спи-ральной линейной РНК с мол.м. 0,2-3,0 МД, кодирует один белок. Общая мол.м. вирионной РНК 12-20 МД. Природа связи фрагментов неясна, вероятно, они соединены друг с другом с помощью белковых молекул. В вирионах реовирусов обнаружено 6-10 полипептидов с мол.м. 15-155 кД. Некоторые белки гликозилированы. Липиды в составе этих вирусов не выявлены. С сердцевиной вирионов ассоциирована транскриптазная активность этого семейства. Реовирусы размножаются в цитоплазме клетки с образованием характерных цитоплазматических включений, содержащих РНК и вирусные белки. Формирование вирионов тесио связано с микротрубочками. Генетическая рекомбинация между различными реовирусами в пределах рода происходит очень эффективно. В основе механизма рекомбинации лежит перераспределение (реассортация) фрагментов РНК (1а).

Наибольшее значение в инфекционной патологии животных имеют представители рода Reovirus и Orbivirus, молекулярная биология которых подробно описана в недавних работах (2). Они вызывают заболевание у телят, поросят, ягнят, цыплят и индюшат. Параротавирусы изучены недостаточно, т.к. они не размножаются в культуре клеток. Только ротавирус свиней группы С удалось серийно пассировать в первичной культуре клеток почек поросят и перевиваемой культуре клеток МА-104 (Рис.5). Ротавирусы других групп называют атипическими или параротавирусами.

Семейство Reoviridae состоит из 9 родов: 1) Orthoreovirus; 2) Orbivorus; 3) Coltivirus; 4) Rotavirus; 5) Aquareovirus; 6) Cypovirus; 7) Phytoreovirus; 8) Fijivirus и 9) Oryzavirus. 1.

Род Orthoreovirus (от греч. orthos - правильный) включает реовирусы типов 1, 2 и 3 (прототипный вирус). Естественные хозяева этого рода вирусов - люди, обезьяны, КРС, собаки, птицы и летучие мыши. Диаметр вирионов составляет 76 нм, сердцевины - 52 нм. Ch- сердцевины отходят 12 полых выступов (шипов), которые достигают наружной поверхности вириона. Через эти выступы выходят синтезированные транскрипты. Мол.м. вирионов 130 МД, коэффициент седиментации их 730S. Они устойчивы к воздействию эфира н стабильны при pH 3-9. В вирионах и сердцевинах содержится соответственно 14 и 44% РНК, доля гуанина (Г) и цитозина (Ц) составляет 44%. Кроме 2-спиральной РНК в вирионах обнаружено

Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции около 3000 1-спиральных олигонуклеотидов длиной от 2 до 20 нуклеотидов. Геном состоит из 10 фрагментов 2-спиральной РНК с мол.м.0,5-2,7 МД, общая мол.м. РНК 14-15 МД; в вирионах обнаружено 9 полипептидов с мол.м.38-155 кД, 3 из которых входят в состав наружного капсида. Минорный полипептид наружного капсида - типоспецифический АГ. 2.

Род Orbivirus (от лат.orbis - кольцо) включает вирусы блутанга (24 серотипа), африканской чумы лошадей, эпизоотической геморрагической болезни оленей, энцефалоза лошадей, Кемерово, Чангинола, Коррипарга, Юбенанджи, Пальям, Валлал, Варрего (2 серотипа) (2).

В вирионах содержится 20% РНК, доля Г+Ц составляет 42-44%. Геном состоит из 10 фрагментов 2-спиральной РНК с мол.м. 0,5-2,8 МД; общая мол.м. РНК 15 МД. В вирионах обнаружено 7 полипептидов с мол.м. 35-150 кД, 2 из которых (Р2 и Р5) входят в состав наружного капсида. Полипептиды наружного капсида содержат типоспецифические АГ детерминанты и индуцируют синтез ВНА. Естественными хозяевами орбивирусов являются люди, обезьяны, лошади, КРС, олени, овцы, кролики, мышата-сосуны, насекомые и клещи. Вирусы передаются от одного хозяина к другому кровососущими членистоногими. 3.

Род Coltivirus (от англ. Colorado tick fever) включает вирус колорадской клещевой лихорадки (прототипный вирус) и вирусы, выявленные в Индонезии и Китае у КРС, свиней, человека, москитов и клещей. Вирионы колтивирусов имеют диаметр 80 нм. Выступов иа поверхности сердцевин не обнаружено. Представители рода теряют инфекционность при pH 3,0.

Геном состоит из 12 фрагментов 2-спиральной РНК с мол.м. 0,24-2,5 МД; общая мол.м. РНК 18 МД. 4.

Род Rotavirus (от лат. rota - колесо) играет важную роль среди инфекционных агентов, вызывающих острые гастроэнтериты у молодых животных различных видов. Типичный представитель рода - ротавирус человека (SA 11 - прототипный вирус). В состав рода включены также ротавирусы обезьян, КРС, свиней, лошадей, овец, коз, оленей, собак, кроликов, кошек, морских свинок, мышей и птиц.

Все ротавирусы по наличию группоспецифического Г А, выявляемого различными методами (ИФ, ИФА, ИЭМ), подразделяют на 7 групп: А, В, С, D, Е, F, G.

Род Cypovirus (от англ. cytoplasmic polihedrosis) включает вирусы цитоплазматического полиэдроза тутового шелкопряда Bombyxmori (прототипный вирус) и многих насекомых отрядов двукрылых (Diptera), чешуекрылых (Lepidoptera), перепончатокрылых (Нуте- noptera). Диаметр вириоиов 50-65 нм, мол.м. 50 МД, коэффициент седиментации 370-440 S. Вирионы устойчивы к действию эфира и стабильны при pH 3,0. Геном состоит из 10 фрагментов 2-спиральной РНК с мол.м.

Роды 7. Phytoreovirus, 8. Fijivirus и 9. Oryzavirus включают реовирусы растений.

Посредством ИФА у ротавирусов выявлены подгруппоспецифические АГ, которые связаны с белком внутреннего капсида VP6 и белком сердцевины VP2. По наличию подгруппоспецифических АГ- детерминант ротавирусы подразделяют на 4 подгруппы. Большинство ротавирусов животных входит в состав первой подгруппы. Типоспецифические АГ ротавирусов ассоциированы с белками наружного капсида VP4 и VP7. По наличию типоспецифических детерминант в белке VP7 ротавирусы подразделяют на 11 серотипов: G-серотипы (табл.1.1). У животных и у птиц обнаружено 7 серотипов ротавирусов (3, 4, 5, 6, 7, 10 и lift): у свиней - 4 (3, 4, 5, 11-й), у КРС - 2 (6, 10-й), у лошадей - 2 (3, 5-й) и по одному у жи- Таблица 1.1. Классификация ротавирусов группы А иа основании

типоспецифических детерминант наружного капсидного белка CVP7 (2) Серотип Источник Штамм G1 Человек Wa,Ku,RV4,K8,M22,M3 7,D, S12,Mont, W17 9, W,Fh G2 Человек DS1, S2,RV5,RV6,HN 144,HN126,KUN, 1076,1171 G3 Человек Ito,YO,P,M,Nemoto,AU 1 ,RV3,W178,PCP5,MZ58, МО, AK3 5, ST 8,McN, 14,15 Обезьяна SA-11,RRV Свинья СКЦ8бЬВК 1 Збфе/7 6 Собака K9,CU1 ,A79-10,LSU79C-36 Кролик Alabama,Cll,R2 Мышь EB,EW Кошка Taka,CAT2,CAT3,CAT22,CAT97 Лошадь H2,F114 G4 Человек Hochi,Hosakawa, V A70,57M, ST 1, ST3 Свинья Gotfried, SB 1 A,SB2,BEN 144,B470 G5 Свинья OSU,K,TER41 ,EE,CN86,CC86,A5 80 Лошадь HI G6 КРС NCDV,UK,C486,RF,WC3,B641 G7 Цыпленок Ch2 G8 Индейка Tyi Человек 69M,B37,B38,PA171 ,HAL3809,HAL5241 ,HAL6271 HAL8590,HAL 1166,HAL 1272 G9 Человек W161,F45,AU32 G10 КРС B233 G11 Свинья YM Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции вотных остальных видов. Третий серотип ротавирусов выявлен у 7-и видов животных. Наибольшее число серотипов (6) идентифицировано у человека. По наличию типоспецифических АГ-детерминант на белке VP4 (протеазочувствительном), ротавирусы подразделяют на Р-серотипы.

Отличительная черта структуры ротавирусов - наличие 132 каналов, пронизывающих наружный и внутренний капсиды и соединяющих наружную поверхность вириона с сердцевиной. Эти каналы обеспечивают проникновение метаболитов, необходимых для транскрипции РНК, и выход вновь синтезированных молекул РНК из сердцевины. В препаратах ротавирусов встречают 2-капсидные и 1-капсидные частицы, а также частицы, лишенные сердцевины (“пустые” вирионы). Диаметр 2-капсидных частиц 70-75 нм, 1-капсидных 60-70 нм. Под электронным микроскопом вирионы ротавирусов напоминают колесо с широкой ступицей (сердцевина), короткими спицами (внутренний капсид) и четко очерченным ободом (наружный капсид). Поэтому они получили такое название - ротавирусы (от лат. rota - колесо).

Структурные белки. В вирионах ротавирусов обнаружено 6 белков, 3 из которых (VP1-VP3) входят в состав сердцевины, причем белок VP2 составляет 15 % массы всех белков (табл.1.2). Белок VP6 - основной компонент внутреннего капсида, на его долю приходится примерно половина массы вирионных белков. Наружный капсид состоит из 2-х белков (VP4 и VP7), один из которых - VP7 - гликозилирован. Белки наружного капсида - очень важные компоненты вириона. Они ответственны за прикрепление вирионов к поверхности клетки, обусловливают ГА и индуцируют синтез ВНА. Под воздействием трипсина белок VP4 расщепляется на 2 белка (VP5 и VP8), в результате чего повышается инфекционная активность вируса.

Таблица 1.2. Характеристика структурных белков ротавирусов Обозначение

белка Молекулярная масса, кД Содержание в вирионе, % от массы всех белков Локализация VP1 125 2 Сердцевина VP2 102 15 Сердцевина VP3 98 0,5 Сердцевина VP4 87 1,5 Наружный капсид VP6 45 51 Внутренний капсид VP7 37 30 Наружный капсид

В вирионах ротавирусов обнаружена РНК-зависимая РНК-полимераза (транскриптаза), которая связана с сердцевиной вирионов. Транскриптаза проявляет активность после удаления белков наружного капсида. Вероятно, белки сердцевины VP1 и VP3 обладают транс- криптазной активностью. Для проявления актив ости вирион-ассоциированной транскрипта- зы in vitro необходимо присутствие в системе всех 4-х рибонуклеозилтрифосфатов и ионов Mg2+. Продуктом полимеразной реакции являются 1-спиральные молекулы РНК, которые чувствительны к действию РНК-азы и полностью гибридизируются с вирионной РНК. Кроме транскриптазы в составе вирионов обнаружены поли(А)-полимераза, гуанилилтрансфе- раза, метилтрансфераза и нуклеотидфосфогидролаза.

Структура генома. Геном ротавирусов состоит из 11 уникальных фрагментов 2- спиральной РНК с мол.м. от 0,2 до 2,2 МД. Суммарная мол.м. всех фрагментов РНК ротавирусов 11-14 МД. Фрагменты РНК присутствуют в вирионах в эквимолярных количествах. Природа связи фрагментов РНК не ясна. Фрагменты РНК могут быть разделены при электрофорезе в полиакриламидном геле или агарозе. В соответствии с электрофоретической подвижностью фрагменты РНК подразделяют на 4 класса: 1 класс включает фрагменты 1-4;

Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции 2 класс - фрагменты 5 и 6; 3 класс - фрагменты 7-9; и 4 класс - фрагменты 10-11. Электрофоретическая подвижность фрагментов РНК внутри классов ротавирусов не одинакова не только у животных разных видов, но и одного вида. Подвижность 10 и 11-го фрагментов РНК у различных ротавирусов сильно варьирует. В связи с этим различают “длинные” и “короткие” электрофоретипы РНК ротавирусов, соответствующие большей и меньшей электрофоретической подвижности этих фрагментов.

Степень родства между геномами разных ротавирусов определяют гибридизацией синтезированных in vitro 1-спиральных фрагментов РНК с соответствующими 2-спиральными фрагментами геномной РНК гомологичного н гетерологичного вирусов. Частичная гомология обнаружена между геномами ротавирусов телят и обезьян.

В последнее время выяснены кодирующие функции каждого фрагмента вирионной РНК ротавируса обезьян SA-11 и определена его полная первичная структура генома (табл. I. 3).

Таблица 1.3. Характеристика фрагментов геномной РНК н

кодируемых ими белков ротавирусов обезьян SA-11 Номер

фрагме

нта Фрагмент генома Продукт трансляции Локализация длина число некодирующих (Ьоаг- нуклеотидов мента 5’-конец 3’-конец п.н. Обозна- Число Мол. чение амино- м.

кислот кД 1 3302 18 17 VP1 1088 125 Сердцевина 2 2690 16 28 VP2 881 102 « 3 2591 49 35 VP3 835 98 « 4 2362 9 22 VP4 776 86 Нар. Капе 5 1611 30 93 NS53 495 58 Нестр.бел. 6 1356 23 139 VP6 397 44 Вн. Капсид 7 1104 25 131 NS34 312 36 Нестр.белок 8 1059 46 59 NS35 317 36 « 9 1062 48 33 VP7(Gp) 326 37 Нар. Капсид 10 751 41 182 NS28(GP) 175 20 Нестр.белок 11 667 21 49 NS26 198 21 « Обозначения: вр- гликопротеин; кД - килодальтон; УР - структурный вирусный белок; N8 - неструктурный белок (число показывает мол.м. в кД); п.н. - пар нуклеотидов

Для установления кодирующей функции генома ротавирусов фрагменты РНК разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле, денатурируют при высокой температуре, транслируют in vitro и идентифицируют продукты трансляции. Трансляции подвергают также РНК, синтезированные in vitro с помощью вирион-ассоциированной РНК-полимеразы.

Геном ротавируса обезьян SA-11 состоит из 18 555 пар нуклеотидов. Длина фрагментов генома варьирует от 667 (11-й фрагмент) до 3302 (первый фрагмент) пар нуклеотидов. На концевых участках всех фрагментов содержатся нетранслируемые консервативные последовательности, которые необходимы для инициации транскрипции, репликации и трансляции вирусных генов. Нетранслируемые участки составляют лишь 6,3 % длины генома.

Свойства и функции белков ротавирусов

Белки сердцевины и внутреннего капсида. Белок VP1 кодируется 1-м фрагментом генома у всех изученных ротавнрусов и входит в состав сердцевины. В сыворотке крови естественно и экспериментально инфицированных животных АТ к белку VP1 не выявляются. Сравнение аминокислотной последовательности белка VP1 у ротавирусов обезьян, КРС и человека выявило высокую степень гомологии (89-96 %). Незначительное количество этого белка, содержащееся в вирионе, (около 2 % массы всех белков) свидетельствует о том, что

Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции он скорее является частью энзиматического комплекса, чем выполняет структурную роль. Вероятно, белок VP1 - компонент вирион ассоциированной транскриптазы.

Белок VP2 кодируется 2-м фрагментом генома и в качестве основного белка (15 % массы всех белков) входит в состав сердцевины. Он связывается с 1- и 2-спиральной РНК ротавирусов и содержит 2 обогащенных лейцином участка. У ротавирусов обезьян, КРС и человека установлена высокая степень гомологии (91-92 %) этого белка. По-видимому, белок VP2 связывает фрагменты генома друг с другом и играет важную роль в сборке вирионов.

Белок VP3 кодируется 3-м фрагментом генома и служит минорным компонентом сердцевины (0,5 % массы всех белков). Идентификация этого белка затруднялась из-за его низкого содержания в вирионах и зараженных клетках. Белок VP3, вероятно, - компонент РНК- полимеразы и совместно с белком VP1 принимает участие в репликации вирусной РНК.

Белок VP6 кодируется 6-м фрагментом генома и является единственным белком внутреннего капсида. Он составляет 51 % массы всех вирионных белков. В изолированном состоянии и в составе вирусных частиц представляет собой тример. Обладает кислыми свойствами и полимеризуется с образованием трубчатых структур при низком значении pH. Участвует в транскриптазной активности 1-капсидных частиц. Удаление его из этих частиц сопровождается потерей транскриптазной активности. Добавление белка приводит к восстановлению активности, однако непосредственно он не вовлекается в транскрипцию. Вероятно, белок VP6 обусловливает конформационные изменения сердцевины, необходимые для функционирования полимеразного комплекса. Белок VP6 содержит группоспецифические и подгруппоспецифические детерминанты. С помощью монАТ установлено наличие 5-и не перекрывающихся детерминант. Роль его в индукции протективного иммунитета не ясна.

Белки наружного капсида. Белок VP4 кодируется 4-м фрагментом генома и представляет негликозилированный минорный компонент наружного капсида (1,5% массы всех белков). Он ответствен за Г A-активность и синтез ВНА. В присутствии трипсина белок VP4 расщепляется на 2 белка с мол.м. 60 кД (VP5) и 28 кД (VP8). В результате расщепления белка повышается инфекционная активность вируса. Процесс протеолитической активности ротавирусов при нарезании белка наружного капсида аналогичен процессу расщепления поверхностных белков у пара- и ортомиксовирусов. Белок VP4 функционирует на ранних этапах взаимодействия вируса с клеткой. Расщепление его активизирует проникновение вируса через плазматическую мембрану, но не влияет на его взаимосвязь с клеткой. Этот белок индуцирует у животных протективный иммунитет. Белок VP4 ротавирусов животных состоит из 776 аминокислот и расщепляется трипсином в 2-х сайтах (аргинин 241 и аргинин 247), причем расщепление во 2-м сайте происходит чаще с помощью монАТ. В белке VP8 обнаружены серотипоспецифические, а в белке VP5 - эпитопы, перекрестно реагирующие в PH.

Белок VP7 кодируется девятым фрагментом у ротавируса обезьян SA-11 (8-м фрагментом у ротавируса КРС) и является гликозилированным основным компонентом наружного капсида (30% массы всех белков). Он состоит из 326 аминокислот и содержит 2 тандемных гидрофобных участка на N-конце и один сайт гликозилирования в положении 69-71. У некоторых штаммов ротавирусов КРС и человека этот белок имеет 2 сайта гликозилирования. Первые 50 аминокислот этого белка представляют собой сигнальную последовательность, которая отщепляется и не входит в состав вириона. Белок VP7 - основной протективный АГ, вызывающий образование ВНА, ответственен за прикрепление вируса к клеткам. АТ к этому белку блокируют адсорбцию вируса на клетках. Вероятно, участок белка VP7, обусловливающий адсорбцию вируса, находится на карбоксильном конце белка (аминокислоты 275- 295). В VP7 выявлены серотипспецифические и перекрестно реагирующие эпитопы нейтрализации. Конформация белка VP7 определяется дисульфидными связями и необходима для сохранения нейтрализующих эпитопов. Гипериммунная сыворотка к очищенному денатурированному белку VP7 не обладает нейтрализующей активностью. Нейтрализующие монАТ не реагируют с денетурированным белком VP7. Гликозилирование белка VP7 не является Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции необходимым условием для адсорбции и проявления инфекционной активности вируса, однако углеводные остатки играют важную роль в стабилизации вирусной частицы и экспонировании антигенных детерминант в этом белке.

Неструктурные белки. Белок NS53 кодируется пятым фрагментом генома и обнаруживается в инфицированных ротавирусами клетках на ранних стадиях инфекции. Синтез белка, вероятно, контролируется, так как в инфицированных клетках он образуется в меньших количествах, чем в бесклеточной белоксинтезирующей системе. Однако о механизме регуляции синтеза этого белка в клетках ничего не известно. Белок NS53 обладает основными свойствами и содержит 2 участка связывания с Zn в положении 54-66 и 314-327. Белки, связывающие Zn, обычно взаимодействуют с нуклеиновой кислотой. Возможно, белок NS53 участвует в репликации вирусной РНК. Белок NS35 кодируется фрагментами 7-9 генома в зависимости от штамма ротавируса (UK - 7-м, SA-11 - 8-м, RRV - 9-м фрагментом) и обладает основными свойствами. Иммуноцитохимическими методами выявлена связь этого белка с виропластами в инфицированных клетках. Полагают, что он принимает участие в репликации вирусной РНК или в упаковке 1-спиральных РНК в субвирусные частицы.

У ротавируса обезьян SA-11 белок NS34 кодируется фрагментом 7 и обладает кислыми свойствами, обнаруживается в комплексах, изолированных из инфицированных клеток и содержащих репликазную активность, возможно - компонент вирусной репликазы.

Белок NS28 кодируется 10-м фрагментом генома и является гликопротеином. На N- конце этого белка имеется неотщепляемая сигнальная последовательность, в которой локализованы 2 сайта гликозилирования. Белок NS28 N-концом встроен в мембраны эндоплаз- матического ретикулюма, а его С-конец находится в цитоплазме. Цитоплазматический фрагмент белка принимает участие в морфогенезе вирусных частиц и служит рецептором для 1-капсидных частиц, обеспечивая их почкование в просвет эндоплазматического ретикулюма. Гликозилирование его необходимо для удаления временной (транзитной) оболочки из почкующихся частиц. Добавление туникамицина (ингибитора гликозилирования) приводит к накоплению оболочечных частиц в клетках.

Белок NS26 кодируется 11-м фрагментом генома, обогащен серином и треонином и является фосфопротенном. Он связан с виропластами в инфицированных клетках и, вероятно, участвует в репликации вирусной РНК.

Антигенная вариабельность и родство. В настоящее время различают не менее 4-х серотипов ротавируса человека (16). Известно о существовании не менее 3-х серотипов ротавирусов группы А свиней (3). Кроме того известны ротавирусы свиней, относящиеся к се- рогруппам В, С и Е (15). Серогрупповая серотиповая вариантность имеет место у ротавирусов КРС и других животных. В перекрестной PH тесное АГ-родство выявлено мелщу ротавирусами обезьян и свиией, а также между ними и ротавирусами КРС. Г омология первичной структуры VP7 различных серотипов достигала 71-85 % (11а, 14). Различная степень АГ-родства по VP4 обнаружена между ротавирусами, выделенными от свиней, человека, обезьян и собак (20).

Шт.АН-1, выделенный от человека, характеризовался высокой гомологией с ротавирусом, выделенным от кошек (FRV-1) (17). От КРС при диарее выделен ротавирус, геномная РНК которого была аналогичной ротавирусу птиц (10). Ротавирусы человека и свиней имели высокую степень гомологии нуклеотидных последовательностей и могли иметь общего предка (18). В другие АГ-группы также входят ротавирусы, поражающие различных хозяев. Вирусы, имеющие одного хозяина, могут настолько сильно различаться между собой, что представляют разные группы. Штаммы ротавирусов, относящиеся к одному серотипу, но выделенные от животных разных видов, часто имеют более тесную связь, чем штаммы различных серотипов, выделенные от животных одного вида (3). В группу В входят ротавирусы человека, КРС, в группу С - человека и свиней, группа Е и F - свиней, группу D - птиц (8). Геномный 4-й сегмент ротавируса обезьян происходит от ротавируса КРС. Ротавирусы обезьян, свиией и кроликов в экспериментальных условиях легко инфицировали телят (11). Ротавирус человека вызывал летальную инфекцию у новорожденных поросят при оральном заражении (19). Существуют ротавирусы, обладающие двойной субгрупповой специфичностью. Такая уникальная способность обнаружена, например, у ротавируса лошадей (шт. F1-14), который взаимодействовал с АГ 1-й и 2-й субгрупп (13). Известен штамм ротавируса свиней с двойной серотипоспецифичностью (G3 и G5) (16). Природа АГ-полиморфизма у ротавирусов пока не выяснена. Приведенные данные свидетельствуют о возможности пересечения ротавирусами видовых барьеров и их миграции между различными классами и видами млекопитающих в естественных условиях (10).

В последнее время у КРС, свиней и человека были обнаружены атипичные ротавирусы, не имеющие группоспецифического АГ, несмотря на типичную для ротавирусов морфологию. Они были названы параротавирусами. Атипичные штаммы были обнаружены в 5% случаев при ротавирусных инфекциях у свиней ив 1% - при ротавирусных диареях у КРС. При изучении с помощью ЭФ в ПААТ выявлены различия в профиле геномов этих штаммов и типичных ротавирусов (17а). В 1988 г. в Японии был выделен новый вирус Shenzam. Он вызывал спорадические случаи врожденных аномалий и гидроэнцефалит у телят. У КРС при внутривенном введении его обнаруживается только лейкопения. В эритроцитарной фракции крови вирус определяется в течение нескольких недель. Помимо эритроцитов вирус выявляли также во фракции тромбоцитов и никогда не обнаруживали в лейкоцитарной фракции. При иитрацеребральном заражении у телят развивалась летальная инфекция с тяжелыми невралогическими поражениями. Этот вирус выделяли из мозжечка, лимфоузлов.

Вирус Shenzam относится к роду Orbivirus, подгруппе Poliam (12). Двунитчатая геномная РНК шт.К-47 вируса Shenzam состоит из 10 фрагментов с мол.м. от 2,35-106 до 9,32-106. Тотальный размер его генома равен 11,75 МД. Среди 10-и структурных вирионных белков его масса варьирует от 23 до 130 кД; три (95, 86 и 23 кД) являются мажорными. Вирус Shenzam хорошо репродуцируется в клетках ВНК-21 (тнгрЮ7 ТЦДзолш). На его основе разработана инактивированная вакцина, предотвращающая лейкопению и внремию (116,12).

Полагают, что этот вирус, возможно, является этиологическим агентом конгенитальных деформаций у КРС, относится к серогруппе Polyam рода Orbivirus, сем. Reoviridae и представляет собой новый серотип.

Параротавирусы свиней, в отличие от ротавирусов, вызывают образование синцитиев из энтероцитов в тонком кишечнике. Отмечена АГ вариабельность среди параротавирусов свиней (7). Несмотря на выраженную АГ специфичность, ряд ротавирусов индуцирует ВНА к гетерологичным ротавирусам.

Вирулентность. Для идентификации генов, ответственных за вирулентность, животных заражают одновременно 2-мя штаммами ротавирусов, обладающими различной вирулентностью. В результате смешанной инфекции происходят обмен фрагментами генома (пересортировка генов) и образование реассортантов. При исследовании реассортантов, содержащих различные комбинации фрагментов, установлено, что 4-й фрагмент генома ротавирусов ответствен за вирулентность. Продукт этого гена (белок наружного капсида VP4) обусловливает проникновение вируса в клетку. МонАТ к этому белку блокируют проникновение вируса через клеточную мембрану.

Вирулентность ротавирусов, вероятно, также связана с 9-м фрагментом генома, кодирующим белок наружного капсида VP7. Этот белок определяет взаимосвязь между вирусом и клеткой. МоиАТ к белку VP7 ингибируют адсорбцию вируса на клеточной поверхности.

Референс-штаммы ротавирусов животных - штаммы: бычий NCDV, свиной OSU, обезьяний СА-11, человеческий шт. NA. В перекрестной PH выявлено АГ различие штам-

Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции мов ротавируса (BRV007, BRV-14, HN-7, BRV6555) КРС от референтного бычьего штамма рогавируса NCDV. Изолят RO 1845 рогавируса человека, выделенный в Израиле, оказался первым изолятом, обладающим Г А активностью (17).

Молекулярно-биологические подходы к созданию вакцин. Поверхностные белки ротавирусов VP4 и VP7 - иммуногены, индуцирующие синтез ВНА. Поэтому для конструирования субъединичных вакцин можно использовать пустые капсиды, изолированные белки наружного капсида и синтетические пептиды, соответствующие АГ детерминантам белков VP4 и VP7. В связи с множественностью серотипов ротавирусов представляет интерес получение вакцинных штаммов-реассортантов, которые содержат фрагменты генома, кодирующие белки VP4 и VP7 из различных серотипов. При этом реассортанты ротавирусов индуцируют у животных иммунный ответ к обоим родительским штаммам рогавируса. Перспективен также метод получения генно-инженерных вакцин, ос-нованный на выделении фрагментов 4 и 9 генома, получении ДНК-копий и экспрессии их в прокариотических или эукариотических клетках при использовании соответствующих генно-инженерных конструкций. Синтезированные белки VP4 и VP7 вызывают образование ВНА у экспериментальных животных и предохраняют их от заражения ротавирусом.

Особенности репродукции

Адсорбция и проникновение вируса в клетку. Ротавирусы, обработанные трипсином, непосредственно проникают через клеточную мембрану, причем проникновение сопровождается “раздеванием” (удаление внешнего капсида) вириона. В цитоплазме клеток через 5 мин после заражения обнаруживают субвирусные частицы, лишенные наружного капсида. Активация ротавирусов трипсином связана с расщеплением белка наружного капсида VP4 на 2 белка: VP5 и VP8. ВНА блокируют проникновение вируса через плазматическую мембрану. Не обработанные трипсином ротавирусы проникают в клетку в результате рецепторного эн- доцитоза и через 20 мин их обнаруживают в лизосомах. Однако они не подвергаются “раздеванию” и не происходит продуктивной инфекции.

Транскрипция. Геном ротавирусов транскрибируется в составе субвирусных частиц в цитоплазме с помощью вирионной РНК-зависимой РНК-полимеразы. При этом транскрипции подвергаются лишь минус-нити 2-спиральных фрагментов РНК. Синтезированные плюс-РНК представляют собой полноразмерные копии всех 11 фрагментов РНК и не подвергаются аутогибридизации. Они не содержат поли (А)-последовательности и функционируют как информационные РНК (и РНК), направляя синтез вирусных белков в бесклеточной белоксинтезирующей системе.

Синтез и РНК ротавирусов в инфицированных клетках подвергается качественному и количественному контролю. Качественный контроль обнаружен только при подавлении синтеза белка в инфицированных клетках. В этих условиях транскрибируются лишь 4 фрагмента РНК. Количественная регуляция выражается в том, что и РНК одних фрагментов синтезируются в гораздо большем количестве, чем и РНК других фрагментов. Синтез иРНК сохраняется на высоком уровне в течение 9-12 ч после заражения. В системе in vitro вирусные сердцевины не обладают транскриптазной активностью, однако добавление в смесь белка VP6 восстанавливает эту активность. Вероятно, активация РНК-транскриптазного комплекса связана с конформационным изменением сердцевины.

Трансляция. В клетках синтезируются 6 структурных и 5 неструктурных вирусспеци- фических белков. Структурный белок VP7 и неструктурный белок NS28 гликозшшрованы и синтезируются на рибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума. Два структурных белка (VP4 и VP7) подвергаются посттрансляционному процессингу. Вновь синтезированные белки обнаруживают в клетках через 4 ч после заражения.

Репликация РНК. 1-спиральные плюс-РНК, синтезированные на 2-спиральной родительской РНК, служат матрицами для синтеза минус-РНК. Синтез 2-спиральных РНК осу- Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции ществляется во вновь образующихся субвирусных частицах (репликазные частицы), которые в процессе репликации РНК претерпевают структурные изменения.

Формирование и выделение вирионов. Вирионы ротавирусов формируются по принципу самосборки. В результате процессов самосборки в виропластах образуются сердцевины и 1-капсидные вирусные частицы. Вероятно, белок VP2 связывает фрагменты генома и играет важную роль в сборке сердцевины. Неструктурные вирусные белки, по-видимому, также участвуют в этом процессе.

Созревание рогавирусов происходит почкованием 1-капсидных частиц через мембраны эндоплазматического ретикулума в вакуоли с покрытием их псевдооболочкой. В просвете вакуоли псевдооболочка утрачивается, формируется наружный капсид и появляются зрелые вирионы. Неструктурный белок-гликопротеин NS28, встроенный в мембраны эндоплазматического ретикулума, играет существенную роль в созревании вирионов. Он, вероятно, обеспечивает связь белка наружного капсида VP7 с 1-капсидными частицами при сборке вирионов. При подавлении гликозилирования туникамицином псевдооболочка с поверхности вирусных частиц не удаляется и 2-капсидные вирионы не обнаруживаются. Формирование наружного капсида существенно зависит от концентрации ионов Са2+. При отсутствии их в культуральной среде почкования не происходит и зрелые вирионы в зараженных клетках не выявляются. Вирионы рогавирусов выходят из клеток после их лизиса (2).

Инфекционность ротавирусов. Наличие внешнего капсидного слоя необходимо для проявления иифекционности рогавирусов и транскригтгазной активности. В популяции вирионов ротавируса телят “гладкие” (с двойным капсидным слоем) и “шероховатые (лишенные наружного капсидного слоя) в градиенте CsCl имеют плотность 1,36 и 1,38 г/см3 соответственно, причем, первые в расчете на вирион обладают в 1000 раз более высокой инфекционностью, чем вторые. Для концентрации ротавирусов используют фреон, который удаляет покрывающие вирус компоненты хозяина и способствует сорбции на фильтрах, что обеспечивает выделяемость его от больных до 90%. Данный метод позволяет накопить концентрированный вирус для биохимических исследований. Наблюдалось различие в патогенности 2-х ротавирусов свиней, различающихся ростовыми характеристиками. Так, вариант 4F ротавируса свиней, который репродуцировался более медленно и образовывал мелкие бляшки in vitro, имел более быстро мигрирующий ген и оказался патогенным для свиней, тогда как вариант 4S был не патогенен (9).

Культивирование. Предложен способ получения рогавирусных АГ в клеточных культурах с последующей очисткой и концентрированием их. С целью повышения выхода АГ в среду за 24 ч до заражения клеточной культуры добавляют гидрокортизон в количестве 0,

03-0,07 мг/мл. Очистку и концентрирование осуществляют адсорбцией ротавирусного АГ на сорбенте при pH 4,0-5,0 с последующей элюцией при pH 8,2 (1).

Диагностика и идентификация ротавирусных инфекций. Разработан новый метод индикации рогавирусиого АГ с использованием Staphylococus aurens Cowan-1 (6). Для выявления генетического различия и сходства между ротавирусами млекопитающих предложен метод РНК-РНК-блот-гибридизации с применением в качестве зондов меченых Р32 полных наборов 11 геномных РНК из нескольких штаммов. В большинстве случаев степень сходства нуклеотидных последовательностей оказалась выше в случае пар штаммов рогавирусов, выделенных от одного и того же хозяина. Однако из этого правила наблюдались и исключения. В частности, выделенный от человека шт.АИ-1 характеризовался высокой гомологией с кошачьим iirr.FRV-1 (17). Для идентификации вариантов РВ предложено использовать метод точечной ДНК-РНК-блот-гибридизации без радиоактивной метки. В качестве зондов для гибридизации используют меченные биотином 40-члениые синтетические олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные к участку гена VP7 ротавируса. Чувствительность этого метода оказалась более высокой, чем метода ЭФ в ПААГ и ИФА (4, 5). СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Гирин В.Н. и др. Авт.свид.4678836/13 опубл.23.12.91.бюл.47. 1а.Макаров В.В. Вопросы вирусол.,1988 :141. 2. Орлянкин Б.Г. С-х биология, 1991, 2 :131. З.Сергеев В.А. Вир. вакцины, Киев,1993, Урожай. 4.Сюрин В.Н. и др. Диаг. вирус, бол. жив., М, 1991, Агро- промиздат. 5.Филдс и др., Вирусология, 1992. 5а.Фомина Н.В. и др. Вирусы жив., MBA,1991 :388. б.ЧубоваН.В. и др. Клин. лаб. диагн.,1992, 11-12 :64. 7.Askaa J. et.al., Arch Virol, 1984, 80, 4 :291. 8.Bellinzoni R. et.al. J Clin Microb, 1990, 3 :633. 9.Bridger J. et.al., J Gen Virol, 1992, 73, 11 :3011. lO.Brissow et.al., J Clin Microb, 1992, 30 :67. ll.Castrucci G. et.al., Comp Imm Microb Infect Dis. 1988, 2 :71. lla.Charpilienne A. et.al. Ann Inst Posteur Viro, 1986, 137 :71. llb.Goto Y. et.al., Vet Microbiol, 1986, 11 :177. 12.Harasawa R. et.al. Jap. J. Vet. Sei. 1988, 50, 3, 777. 13. Hoshino V. et.al. Virology 1987, 157 :488. 14.Huismans H. et.al., Andersteport J Vet Res, 1981, 48 :51. 15. Juan C.S. et.al., Res Vet Sei, 1986, 41 :270. 16.

Nagesha H.S. et.al., Clin Microb, 1988, 26 :171. 17.Nakagoni O. et. al., Arch Virol, 1991, 120 :43. 17a.Powltry Intern, 1989, 28 :62. 18.Qian Y. et.al., Arch Virol, 1991, 118 :269. 19.Snodgrass D.R. et.al., J Clin Microb, 1991, 29 :2688. 20.Weiss M et.al., Ach Tierheilk, 1987, 129, 139.