Влияние условий культивированияна биосинтез низкомолекулярных метаболитовштаммами бактерий Pseudomonas

Как уже указывалось выше, на образование антибиотических веществ культурами Pseudomonas оказывает влияние природа источника углерода в среде. В наших экспериментах по оптимизации питательной среды [Логинов, Четвериков, 2003] за основу принимали среду Кинг В [King, 1956], в качестве источников углерода использовали глицерин (классический вариант этой среды), сахарозу, глюкозу, ацетамид, пируват (как наиболее универсальные субстраты для псевдомонад [Смирнов, Киприанова, 1990].

При исследовании физико-химических факторов, влияющих на титр клеток и секрецию метаболитов с фунгицидной активностью, переменными величинами являлись концентрации углерода, органического азота и температура культивирования.

Время культивирования - 72 ч. Отбор проб для анализа анти- грибной активности и титра клеток осуществляли через каждые 8-12 ч.

Установлено, что максимальное количество антибиотических веществ образуется культурами на среде с глицерином.

Исследуя влияние природы источников органического азота как второго существенного фактора для накопления в среде наибольшего количества метаболитов с антигрибной активностью в качестве таковых использовали пептон и дрожжевой экстракт. Перечисленные компоненты добавляли в питательную среду как одиночно в количестве 0,5-1,0 мас.%, так и вместе, но так, чтобы суммарное их количество не превышало 1 мас.%. Оптимальным

Таблица 24. Зависимость фунгицидной активности штаммов культур Р. aureofaciens ИБ 51 , /\ aureofaciens ИБ 6 и Р. putida ИБ 17 от состава среды

оказалось одинаковое соотношение дрожжевого экстракта и пептона по 0,5 мас.%, что может быть связано со сбалансированностью факторов роста, витаминов и микроэлементов, входящих в их состав.

Данные по оптимизации источников углеродного и азотного питания приведены в табл.

Существенное влияние на выход антибиотических веществ у псевдомонад оказывает температура выращивания. В связи с этим была изучена способность штаммов Pseudomonas продуцировать антибиотические вещества в оптимизированной жидкой питательной среде при различных температурах культивирования. Оптимальными для секреции низкомолекулярных (НМ) метаболитов с антигрибной активностью являются температуры в диапазоне от 22 до 26 °С, что коррелирует с данными литературы по биосинтезу антибиотических веществ псевдомонадами [Gamard, 1997; Paulitz, 2000; Lee, 2003].

Существенным достоинством культур Р. aureofaciens ИБ 51, Р. aureofaciens ИБ 6 и Р. putida ИБ 17 является способность к активному росту при пониженных температурах.

Проведенными исследованиями (рис. 8) установлено, что на оптимизированной среде при температуре 22 ° штаммы интенсивно накапливают метаболиты с антигрибной активностью на завершающей стадии экспоненциального роста к 28-30-ти часам культивирования, в дальнейшем активность практически не изменяется до окончания выращивания. Причем следовые количества антибиотических веществ обнаруживались в среде уже через 8 ч после начала культивирования.

Рис. 8. Динамика периодического роста и накопления антибиотических веществ культурами Pseudomonas

1-3 - титр клеток, млрд КОЕ/мл КЖ, при 22° (/), 30° (2) и 15° (3); 4-6 - антигрибная активность, ед./мл КЖ, при 22 ° (4), 30 ° (5) и 15 ° (6)

Повышение температуры среды до 30° отрицательно сказывалось на накоплении метаболитов с фунгицидной активностью. Их секреция в среду начиналась после 30 ч, антигрибная активность была невысокой и не увеличивалась до окончания процесса.

Снижение температуры до 15° также приводило к уменьшению образования метаболитов с фунгицидной активностью и задержке их секреции в среду (через 40 ч после начала культивирования), что может быть связано с замедлением роста культур.

При этом максимальный титр клеток оставался высоким вне зависимости от температуры культивирования и составлял (6,5-7,0) • 1010 КОЕ/мл КЖ при 22° и (2,5-3,0) • 10*° КОЕ/мл КЖ при 15° и 30°.