Структура и свойства новых метаболитов Pseudomonas и Azotobacter,обладающих фунгицидной активностью

неочищенных метаболитов, подвергшаяся термообработке от 70 до 100°, имела менее 30% активности по отношению к ненагрева- емой части фракции, поэтому мы предположили, что изучаемые культуры рода Pseudomonas продуцируют комплекс метаболитов, обладающих фунгицидной активностью.

Выделение метаболитов с антигрибной активностью Pseudomonas проводили следующим образом. После удаления биомассы на центрифуге “К23 D” (3000 мин-1, 20 мин) супернатант подвергали ультрафильтрации на модулях волоконного типа “Amicon ЗР-10 “ (США), отбирая фильтрат, содержащий НМ фракцию (^ 3 кДа) внеклеточных метаболитов исследуемых штаммов. Фильтрат упаривали на вакуумном роторном испарителе при 35°, примеси осаждали метанолом и отделяли центрифугированием в тех же условиях. После отгонки метанола из супернатанта изучаемые вещества осаждали ацетоном.

Чистоту и гомогенность выделенных метаболитов проверяли при помощи ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) в системе, состоящей из насоса высокого давления модели 572Р (“Gasukuro Kogyo”, Япония), ультрафиолетового детектора (“Du Pont”, США). Для разделения использовали колонку из нержавеющей стали с сорбентом (размер зерна 5 мкм) Zorbax- ODS (250 х 4,6 мм, “Shimadzu”, Япония). Образцы вводили с помощью дозатора модели 7125 (“Rheodyne”, США) с петлей объемом 20 мкл. В качестве элюента использовали воду, подверженную дополнительной очистке [Сакодынский, 1993; Стыскин, . Расход подвижной фазы 1,0 мл/мин. Пики регистрировали при 254 нм.

Молекулярную массу выделенных метаболитов оценивали при помощи эксклюзионной хроматографии в системе, описанной выше, на колонке TSK G2000SW (300 х 7,8 мм, “Toyo Soda”, Япония) при элюировании смесью 0,1 М NaH2P04 и 0,3 М хлорида натрия (pH 7,0) с расходом 1 мл/мин с УФ-детектировани- ем при 254 нм.

Аминокислотный анализ кислотного гидролизата (6н НС1, 24 ч, при 105°) метаболитов выполнен на анализаторе Т339М (Чехословакия).

Элементный состав метаболитов определяли на С, Н, N-ана- лизаторе HP Model 185 В (США) и по общепринятым методикам [Климова, 1967].

УФ-спектры записывали на спектрофотометре Specord М40 (“Carl Zeise”, Германия) в области 200-330 нм (в воде).

ИК-спектры записывали на спектрофотометре Specord М80 (“Carl Zeise”, Германия) в области 40СМ000 см-1 (в вазелиновом масле или в тонком слое).

Спектры ЯМР 13С регистрировали на спектрометре Bruker АМХ-Ш-300 (Германия) при рабочей частоте 300,13 МГц с внутренним стандартом - тетраметилсиланом (ТМС) и растворителем CD3OD. Расшифровку спектров проводили при помощи программы ChemNMR Pro.

Схема выделения метаболитов Pseudomonas с антигрибной активностью включала в себя стадии центрифугирования, ультрафильтрации, концентрирования, осаждения примесей и осаждения метаболитов.

Центрифугирование КЖ. Стадия удаления биомассы из КЖ - общая стадия для всех методик по выделению экзоцеллюлярных антибиотических веществ.

Ультрафильтрация на модулях волоконного типа. Стадия избавления от высокомолекулярных соединений. Ультрафильтрации подвергают супернатанты со стадии центрифугирования КЖ с отбором фильтратов, заведомо содержащих низкомолекулярные фракции (lt; 3 кДа) внеклеточных метаболитов.

Концентрирование ультрафильтрата. Эту стадию проводили путем упаривания фильтрата на вакуумном роторном испарителе при 35°. Степень концентрирования 20 раз.

Выделение отдельных компонентов полученных таким образом НМ фракций проводили при помощи препаративной ВЭЖХ. Хроматографические профили НМ фракций метаболитов Pseudomonas представлены на рис. 9. Были получены 6 компонентов для штамма Р. aureofaciens ИБ 51, 10 компонентов для штамма Р.

Осаждение примесей. На этой стадии проводили осаждение солей и других остатков питательной среды в концентрате метанолом до 60% насыщения с дальнейшим их отделением центрифугированием и отгонкой метанола из супернатанта под вакуумом. Эту стадию проводили двукратно.

Покомпонентный анализ показал, что фунгицидной активностью обладает лишь один компонент из НМ фракции метаболитов каждого изучаемого штамма Pseudomonas. При хроматографическом разделении эти компоненты первыми выходят с колонки, они также не имеют ярко выраженного максимума поглощения в УФ-области. Остальные компоненты фракций, за некоторым исключением, имеют максимумы УФ-поглощения в

Таблица 25. Характеристики компонентов НМ фракций метаболитов штаммов Pseudomonas

интервале от 265 до 280 нм, характерные для регуляторов роста растений цитокининовой природы, что и было подтверждено данными иммуноферментного анализа.

В результате применения разработанной оригинальной методики выделения в хроматографических профилях элюции выделенных метаболитов присутствовал лишь один пик (см. рис. 9), по времени выхода соответствующий пикам компонентов, обладающих антигрибной активностью (рис. 10), причем время выхода активного компонента для каждого из штаммов Pseudomonas достоверно не различалось.

Температурный оптимум и термостабильность. Максимум активности для изучаемых метаболитов штаммов Pseudomonas наблюдался в диапазоне температур 25-60°, при температуре 70°

Рис. 10. Характерный хроматографический профиль выделенных метаболитов штаммов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью

Условия хроматографического разделения см. рис. 9

происходит значительная термоинактивация, но при этом у штаммов вида Р. aureofaciens 20-25% от начальной активности остается даже после инкубирования при температуре 100°. Такая картина может быть обусловлена наличием во фракциях двух компонентов, обладающих фунгицидной активностью, один из которых имеет пептидную природу и денатурирует при температуре выше 60°, а второй - антибиотик феназиновой природы в следовых количествах, характерный для данного вида бактерий, наличие которого мы установили в наших исследованиях.

рн -стабильность. В интервале pH 6-9 уровень фунгицидной активности НМ фракций метаболитов штаммов Р. aureofaciens ИБ 51 и Р. aureofaciens ИБ 6 остается максимальным и стабильным, критическими точками стабильности являлись значения pH lt; 4 и pH gt;11, после которых активность падала больше, чем в два раза.

Схема выделения метаболитов Azotobacter с антигрибной активностью включала в себя стадии центрифугирования, ультрафильтрации, концентрирования, осаждения метаболитов метанолом и, в общем, вписывалась в схему выделения псевдомонадных

alt="" />

Рис.

1 - вода, 2 - метаболит, 3 - остаточная сахароза

Таблица 26. Схема очистки метаболитов, обладающих фунгицидной активностью, продуцируемых бактериями родов Pseudomonas и Azotobacter

метаболитов, представляя ее упрощенный вариант. Упрощение схемы выделения метаболитов азотобактера объясняется тем, что на используемой среде синтезируется в отличие от псевдомонад только единственный метаболит, что также упрощает хроматографическую оценку чистоты выделенных метаболитов, и где в качестве примесей присутствует только остаточная сахароза (рис. 11).

Схема выделения и этапы очистки метаболитов, обладающих фунгицидной активностью, продуцируемых бактериями родов Pseudomonas и Azotobacter, представлены в табл. 26.

Определение молекулярной массы метаболитов проводили при помощи эксклюзионной жидкостной хроматографии с использованием маркеров молекулярной массы. В результате чего было установлено, что метаболиты штаммов Pseudomonas близки по молекулярной массе, различие составляет ~± 200 Да, и их молекулярная масса варьирует в пределах 2,8-3,0 кДа (рис. 12).

Рис. 12. Типовая хроматограмма метаболитов с антигрибной активностью, выделенных из штаммов Pseudomonas (2, время выхода 15,2 ± 0,1 мин), и маркеров молекулярной массы (7 - инсулин (5,8 кДа), время выхода 11,5 мин, 3 - витамин В12 (1355 Да), время выхода 17,2 мин) (280 нм, колонка TSK G2000SW (300 х х 7,8 мм)), элюент - 0,1 М фосфат натрия, 0,3 М хлорид натрия (pH 7,0), расход 1 мл/мин)

Полученные величины молекулярных масс нашли подтверждение и при использовании метода определения бактериальных пептидов и белков с молекулярной массой lt; 20 кДа, дающего достаточно достоверную информацию об их количестве в частично очищенных смесях и молекулярной массе, основанного на проведении адсорбционной ВЭЖХ с использованием сорбента Ultrasphere Si и предложенном в одной из наших работ [Логинов, 2004].

Аминокислотный и элементный составы метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью. Изучение свойств пептидных факторов, продуцируемых штаммом Bacillus sp. 739 [Широков, 2003], показало, что активность пептидного метаболита с массой до 3 кДа не зависит в значительной мере от температуры. А максимум активности для изучаемых метаболитов штаммов Р. aureofaciens ИБ 51, Р. aureofaciens ИБ 6 и P.puti- da ИБ 17 наблюдался в диапазоне температур 22-26°, при температуре 70° происходила их значительная термоинактивация; в связи с этим можно было предположить, что метаболиты изучаемых псевдомонад имеют сложнокоординированную пептидную природу. Это предположение было подтверждено данными аминокислотного анализа гидролизатов метаболитов. Данные аминокислотного и элементного анализов (табл. 27, 28) также показали, что метаболиты изучаемых штаммов неидентичны по своему

Таблица 27. Эквимолярное содержание аминокислот в структуре триглицеридпептидов, продуцируемых псевдомонадами

Таблица 28. Элементный состав метаболитов бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter, обладающих фунгицидной активностью

составу, различие в одной аминокислоте, чем и определяется разница в их молекулярных массах.

В состав метаболита штамма Р. aureofaciens ИБ 51 входит 19 аминокислот, штаммов ИБ 6 и ИБ 17 - 18 аминокислот, в основном составы схожие, за некоторым исключением. У метаболита штамма Р. aureofaciens ИБ 51 в составе нет лейцина, который присутствует в составе метаболитов штаммов ИБ 6 и ИБ 17, а аспарагиновая кислота и треонин присутствуют в удвоенном количестве.

ИК- и ЯМР 13С-спектроскопия метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью. Сравнение спектров выделенных метаболитов, полученных экспериментально, с расчетными данными в ChemNMR Pro позволило составить их предполагаемую конфигурацию, изображенную на рис. 13 (см. цв. вкл.).

Анализ данных ИК- и ЯМР 13С-спектроскопии показал, что молекулы изучаемых метаболитов содержат глицериновый остов, что характеризуется наличием химических сдвигов (ХС) 65 и 74 м.д. и характерными полосами поглощения в ИК-спектрах на 2968 и 1408 см-1. К молекуле глицерина через эфирные атомы кислорода посредством карбонильных групп (1044 см-1, 170 м.д.) присоединены три полипептидные цепочки, на наличие которых указывает увеличение площади пиков аминогрупп (3100-3200 см-1) и изменение пропускания в области 1500 см-1, характерной для аминных и ацетамидных групп.

Элементный состав, ИК- и ЯМР 13С-спектроскопия метаболитов Az. vinelandii, обладающих фунгицидной активностью. Результаты спектрального анализа метаболитов, продуцируемых штаммами Az. vinelandii, представлены в табл. 29. Наличие в спектре ЯМР 13С химических сдвигов 62,2; 63,0; 66,8; 71,7; 71,8;

Таблица 29. Результаты спектрального анализа метаболитов, продуцируемых штаммами Az. vinelandii

78,9; 106,1 м.д. показывает, что основу метаболитов составляет молекула сахарозы, аминированная с учетом данных элементного анализа (табл. 28) в четырех положениях (на наличие аминогрупп указывают характерные полосы поглощения в ИК-спектре на 2800-3200 см-1). Так как фосфат- и сульфатионов в исследуемых веществах обнаружено не было, учитывая результаты элементного анализа и полос в ИК-спектре, характерных для Р- и

S-связей (1296 см-1), можно говорить о наличии в структуре метаболитов политиофосфатного “хвоста” различного состава для каждого штамма, а структуру самих метаболитов можно представить в виде политиофосфатов тетрааминосахарозы [Логинов, Четвериков, Гусаков, 2003; Четвериков, Логинов, 2005] (рис. 14).

Присутствие в структуре метаболитов полифосфатного “хвоста” косвенным образом согласуется с данными о том, что бактерии р. Azotobacter при росте на молекулярном азоте в латентной фазе образуют значительное количество высокомолекулярных кислотонерастворимых полифосфатов, служащих резервом

Рис. 14. Вероятная структура метаболитов, продуцируемых штаммами Azotobacter vinelandii

Таблица 30. Спектр фунгицидной активности метаболитов, продуцируемых бактериями родов Pseudomonas, Azotobacter и Bacillus

фосфора и энергии, а также использующихся для регенерации АТР. При активации синтетических процессов или при фосфорном голодании клетки накопленные полифосфаты могут потребляться на синтез различных органических веществ, возможно, и веществ с антибиотическими свойствами.

Аитигрибная активность триглицеридпептидов Pseudomonas и поотитиофосфата тетрааминосахарозы Azotobacter. В связи с тем, что выделенные триглицеридпептиды и политиофосфаты тетрааминосахарозы являются новыми группами метаболитов бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter, было интересно определить величину их фунгицидной активности и соотнести ее с таковыми известных метаболитов бактерий р. Bacillus, обладающих антигрибной активностью.

Методом разведений выявлена минимальная ингибирующая концентрация для ряда фитопатогенных грибов (табл. 30), которая является сопоставимой с величинами ингибирования фитопатогенов известными бациллярными пептидными факторами.

Таким образом, установлены оптимальные условия культивирования бактерий р. Pseudomonas, позволяющие получить культуры с высоким титром клеток и максимальной продукцией метаболитов, обладающих фунгицидной активностью, для выделения которых предложена оригинальная схема, в которую вписывается и схема выделения антигрибных метаболитов Azotobacter. Методами жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа, ИК- и ЯМР 13С-спектроскопии показано, что выделенные метаболиты штаммов Pseudomonas и Azotobacter представляют собой соответственно триглицеридпептиды и политиофосфаты аминосахарозы, а это означает, что они не относятся к сидерофорам в классическом понимании.