ВЫДЕЛЕНИЕ И ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАНОВЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙРОДОВ PSEUDOMONAS И AZOTOBACTER -АНТАГОНИСТОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ

Всего проанализировано около 320 образцов: почвы Башкортостана (Мелеузовский, Кугарчинский, Уфимский, Салаватский, Нуримановский, Мечетлинский, Туймазинский районы), почвы Оренбургской, Московской областей, Ставропольского края (Прикумская опытная селекционная станция), Краснодарского края (Адлер, Анапа), образцы с опытно-заливных станций с разной степенью увлажнения, почвенные образцы из Турции, США, Израиля, Китая, Ирана; ризосфера растений семейств злаковых, лютиковых, зверобойных, кирказоновых, первоцветных, маковых, пасленовых, маревых, зонтичных, луковых, бобовых, тыквенных; а также сточные воды биологических очистных сооружений Уфы, Стерлитамака, Орска.

Для выделения бактерий р. Pseudomonas применяли метод накопительных культур с использованием синтетической питательной среды Козера [Смирнов, Киприанова, 1990] с добавлением 0,1% пирувата. Пируват был выбран в качестве источника углерода в связи с тем, что, по данным В.В. Смирнова и Е.А. Киприано- вой [1990], пировиноградную кислоту утилизирует 98% штаммов различных видов псевдомонад. pH среды устанавливали перед стерилизацией с помощью 20%-ного раствора NaOH, pH 6,8-7,2.

В качалочные колбы объемом 250 мл со 100 мл стерильной среды Козера вносили исследуемые пробы в количестве 1 г (мл) и инкубировали на качалке (п = 170 об/мин) при 28-30° в течение 5 сут, после чего содержимое колб высевали на чашки Петри с МПА для получения изолированных колоний.

Для выделения штаммов азотобактера из почвы была использована одна из классических методик - метод посева почвенных комочков по Виноградскому [Рубенчик, 1960].

Метод почвенных комочков заключается в высеве мелких комочков почвы на агаризованную среду, не содержащую азот. Для этого на среду Эшби с добавлением следовых количеств молибдена раскладывали мелкие комочки просеянного почвенного образца (15 комочков на 1 чашку Петри), чашки с комочками инкубировали в термостате при температуре 28° в течение 4—6 сут. При наличии в почвенном образце азотобактера на комочках появлялся характерный слизистый налет, преимущественно состоящий из культур азотобактера. С целью получения чистых изоля- тов проводили высев на чашки Петри с агаризованной средой Эшби для получения изолированных колоний.

Полученные изоляты микроорганизмов исследовали на наличие антагонизма в отношении фитопатогенных грибов. На начальном этапе исследований в качестве тест-объекта был выбран несовершенный гриб Bipolaris sorokiniana Shoem (= Drechslera sorokiniana Subram., Helminthosporium sativum P., K. et В.) - один из возбудителей обыкновенной корневой гнили злаковых культур [Пересыпкин, 1989]. Изучение антагонистических свойств изолятов проводили в чашках Петри на среде ГПА, содержащей 0,5% глюкозы; 0,5% пептона; 0,4% К2НР04; 0,2% КН2Р04 и 1,5% агар-агара в дистиллированной воде, а также на среде КГА. Данные среды были выбраны с целью создания оптимальных условий для одновременного роста культур гриба и бактерий. Суспензию спор тест-гриба высевали на агаризованную среду, а исследуемую культуру вносили, делая посев уколом поверх газона гриба. Чашки инкубировали в термостате в течение 3 сут при температуре 28°. Антагонистов выявляли по наличию вокруг колонии бактерии зоны подавления роста тест-гриба. В дальнейшем данную методику использовали во всех случаях, когда необходимо было определить антагонистическую активность штаммов псевдомонад и азотобактера.

В качестве тест-объектов для определения спектра антагонистического действия штаммов пседомонад и азотобактера служили также следующие мицелиальные грибы: F. culmorum ВКМ 844, F. gibbosum ВКМ 848, F.

Микромицеты под номерами 9,10 и Bipolaris sorokiniana - местные изоляты и хранятся в Коллекции микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН.

Для каждого штамма делали по 5 повторностей (уколов). Количественная оценка антагонистической активности культур представлена величинами диаметров зон ингибирования роста тест-грибов, мм.

Определение культуральных и физиолого-биохимических характеристик культур псевдомонад проводили по стандартным методикам идентификации бактерий р. Pseudomonas [Практикум..., 1976; Скворцова, 1981; Методы..., 1984; Смирнов, Киприа- нова, 1990; Определитель..., 1997].

Определение культуральных и физиолого-биохимических характеристик штаммов азотобактера проводили по стандартным методикам, описанным в “Определителе бактерий Берджи” [Определитель..., 1997), по идентификационным признакам, указанным Л.И. Рубенчиком, Е.Н. Мишустиным [Рубенчик, 1960; Мишустин, Шильникова, 1968], а также Ф. Герхардтом и др. [Методы..., 1984].

Изучение особенностей углеродного питания псевдомонад проводили на агаризованной среде Козера [Смирнов, Киприано- ва, 1990] либо для культуры азотобактера - на агаризованной среде Федорова с внесением 0,1-1% исследуемого источника углерода. Культуры бактерий высевали на чашки штрихом. Рост микроорганизма или его отсутствие отмечали визуально. Контролем служила среда без источника углерода.

В результате обширного скрининга из различных источников было изолировано около 2300 штаммов микроорганизмов родов Pseudomonas и Azotobacter, из которых антагонистическую активность проявили 17 изолятов, наиболее активные из которых представлены в табл. 1. Как видно из таблицы, источниками

Таблица 1. Источники выделения штаммов-антагонистов

Таблица 3. Морфология колоний штаммов-антагонистов р. Pseudomonas при росте на плотных питательных средах

Таблица 4.

выделения новых штаммов служили как традиционные природные биотопы, обеспечивающие высокое биоразнообразие микробного населения - почва ризосферы, так и антропогенные экосистемы. Очевидно, микробиота биологических очистных сооружений, осуществляющая жизнедеятельность за счет разнообразных субстратов, - перспективный источник штаммов, обладающих необходимыми свойствами.

Для дальнейших исследований были отобраны пять штаммов р. Pseudomonas: 51, 6, 56, 17, 182 и три штамма р. Azotobacter: 1, 3, 4, которые продемонстрировали высокую антагонистическую активность в отношении широкого спектра фитопатогенных грибов (табл. 2, рис. 1, 2; см. цв. вкл.).

Определение культуральных и физиолого-биохимических характеристик культур-антагонистов проводили стандартными методами. Морфологию колоний штаммов-антагонистов р. Pseudomonas на питательных средах определяли после 4—5 сут роста при 28° (табл. 3). Особенности роста штаммов в жидкой культуре (в МПБ) и на скошенном агаре МПА представлены в табл. 4. Морфологию колоний штаммов-антагонистов р. Azotobacter определяли после 2-3 сут роста при 28° на питательных средах КГА и Эшби (табл. 5).

Данные, характеризующие физиолого-биохимические свойства штаммов-антагонистов, представлены в табл. 6-10.

Анализ физиолого-биохимических признаков показал, что выделенные штаммы 51, 6, 56, 17, 182 представляют собой подвижные прямые мелкие клетки палочковидной формы; спор не образуют; грам-отрицательные; аэробы; оксидазная реакция - положительная; в органических факторах роста не нуждаются; каталазоположительные (см. табл. 6) и могут быть отнесены к бактериям р. Pseudomonas.

По ряду признаков, используемых для дифференциации псевдомонад, таких как образование оранжевого пигмента, рост при 4°, наличие аргининдигидролазной активности, синтез левана из сахарозы, гидролиз желатины и лецитина, липолиз Твина-80, неспособность к денитрификации и гидролизу крахмала; утилизация сахарозы, галактозы, DL-триптофана, L-аргинина, фенилаланина, а также неспособность использовать в качестве источника углерода сорбит, адипиновую кислоту, DL-метионин, этанол, штаммы 51 и 6 были отнесены к представителям вида Р. aureofa- ciens. Перечисленные выше признаки характерны для более чем 80% штаммов данного вида [Скворцова, 1981; Смирнов, Киприа- нова, 1990; Определитель..., 1997].

Ряд свойств, таких как образование желто-зеленого, флуоресцирующего, диффундирующего в среду пигмента, рост при 4°, наличие аргининдигидролазы, а также отсутствие желатиназной, амилолитической, лецитиназной, левансахаразной активностей, неспособность к денитрификации; утилизация глюкозы, бутанола, пропионовой кислоты, L-аргинина, DL-лейцина, DL-a-аланина, DL-валина, а также неспособность использовать в качестве источника углерода адипиновую, антраниловую, малеиновую кис-

Таблица 7. Характеристика использования питательных субстратов штаммами-антагонистами р. Pseudomonas

лоты, сорбит, ацетамид, позволили отнести изоляты 56 и 17 к представителям вида Р. putida. Упомянутые выше признаки характерны для более чем 80% штаммов данного вида [Скворцова, 1981; Смирнов, Киприанова, 1990; Определитель..., 1997].

Гетерогенность штаммов Р. putida в отношении источников углеродного питания нашла отражение в том, что в пределах вида выделены биовары А и В. Изучение использования выделенными штаммами 56 и 17 ряда источников углерода и сопоставление полученных результатов с данными литературы [Смирнов, Киприанова, 1990] позволило сделать предварительные выводы

Таблица 8. Потребление некоторых источников углерода штаммами 56 и 17 в сравнении с биоварами А и В Р. putida

о том, что фенотипически штаммы 56 и 17 ближе к биовару А (табл. 8).

Таким образом, по совокупности признаков новые штаммы 51 и 6 были идентифицированы как Р. aureofaciens и депонированы в Коллекцию микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН под № ИБ 51 и № ИБ 6; штаммы 56 и 17 были идентифицированы как Р. putida и депонированы в Коллекцию микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН под № ИБ 56 и № ИБ 17.

У культуры 182 по совокупности морфологических, культуральных и биохимических признаков не удалось однозначно установить видовую принадлежность. Этот изолят по своим свойствам схож с Р. putida, но в отличие от представителей этого вида гидролизует лецитин. Вследствие сказанного выше штамм был депонирован в Коллекцию микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН как Pseudomonas sp. ИБ 182.

В соответствии с культуральными свойствами штаммы 1, 3,4 были отнесены к р. Azotobacter. Среди важнейших диагностических характеристик, использованных в процессе идентификации данных изолятов, следует перечислить следующие свойства: грам-отрицательные, на твердых питательных средах, не содержащих азотных соединений, штаммы 1, 3, 4 образуют крупные слизистые, иногда морщинистые колонии [Рубенчик, I960]; отличаются крайне широким спектром потребления источников углерода [Мишустин, Шильникова, 1968], растут на среде с 0,15% бензойнокислого натрия. Не растут (штаммы 1,3) или проявляют слабый рост (штамм 4) на белковых средах, спор не образуют, но имеет место цистообразование, аэробы, фиксируют молекулярный

азот, в молодой культуре все штаммы подвижны, имеют форму палочек с закругленными концами [Рубенчик, 1960] (табл. 9, 10).

Согласно “Определителю бактерий Берджи” из всех видов азотобактера только бактерии, относящиеся к Az. vinelandii, используют рамнозу в качестве источника углерода; кроме того, представители этого вида на среде, дефицитной по железу, образуют флуоресцирующий пигмент. Оба эти свойства были отмечены у всех трех выделенных изолятов, предварительно отнесенных к р. Azotobacter (см. табл. 9, 10).

Еще одной из отличительных черт, характерных для бактерий вида Az. vinelandii, является выделение экзополисахаридов на богатых питательных средах [Пат. РФ 2073712; Horan et al., 1981; Anderson et al., 1987; Brivonese, Sutherland, 1989; Beale, Foster, 1996; Parente et al., 1998; Vargas-Garcia et al., 2003; и др.]. Штаммы 1 и 3 проявили эту способность при росте в жидкой культуре на

Таблица 10. Способность штаммов азотобактера к росту на различных источниках углеродного питания

картофельно-глюкозной среде и на среде Федорова с мелассой в качестве источника углерода, штамм 4 на этих средах также продуцировал экзополисахарид, но в меньшей степени.

Таким образом, по совокупности признаков новые штаммы 1, 3, 4 были идентифицированы как Az. vinelandii и депонированы в Коллекцию микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН под № ИБ 1, № ИБ 3, № ИБ 4.

Таким образом, были выделены и идентифицированы до вида пять новых штаммов бактерий-антагонистов р. Pseudomonas: Р. aureofaciens ИБ 51, Р. aureofaciens ИБ 6, Р. putida ИБ 56, Р. puti- da ИБ 17, Pseudomonas sp. ИБ 182 и три новых штамма р. Azotobacter: Az. vinelandii ИБ 1, Az. vinelandii ИБ 3, Az. vinelandii ИБ 4.