ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКАИ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАБОЛИТОВ,ОБЛАДАЮЩИХ ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ,ПРОДУЦИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ РОДОВ PSEUDOMONASИ AZOTOBACTER

Антибиотические вещества псевдомонад, подавляющих развитие различных групп фитопатогенных бактерий и грибов, давно уже являются предметом интенсивных исследований ученых. Несомненно, что способность штамма к синтезу антибиотических веществ во многом определяет активность бактерии-антагониста.

К настоящему времени у бактерий р. Pseudomonas обнаружено около 100 антибиотических веществ самого разнообразного строения и только не более 20% из них играют роль в подавлении фитопатогенных грибов.
Способность к синтезу ациклических антибиотиков широко распространена у псевдомонад. Но с точки зрения подавления фитопатогенных грибов, можно отметить антифунгин, выделенный Худяковым и др. [1965] из культуральной жидкости Р. mycophaga. Он действует на возбудителя вилта хлопчатника Verticillium dahliae, в связи с чем высказывалось мнение о перспективности его применения в борьбе с грибными заболеваниями растений. В дальнейшем выяснилось [Попова и др., 1971], что антифунгин представляет собой комплексный препарат, содержащий смесь уксусной, пропионовой, масляной, валериановой, капроновой и салициловой кислот. Наиболее активным компонентом среды являлась н-капроновая кислота.
Наибольшее количество публикаций посвящено антибиотикам феназиновой группы, их химической структуре, биологической активности, путям синтеза.
Способность к синтезу гетероциклического феназинового ядра является одной из отличительных особенностей метаболизма бактерий р. Pseudomonas. Многие антибиотики-феназины выделены из псевдомонад сравнительно давно.
Один из наиболее ранних антибиотиков - пиоцианин (синий пигмент Р. aeruginosa) выделен в 1860 г. По химическому строению он представляет собой 9-Ы-метил-1-оксифеназин [Knight et al., 1979].
Наряду с пиоцианином в КЖ штаммов Р. aeruginosa были обнаружены и другие пигменты - гемипиоцианин и оксихлорора- фин. Оксихлорорафин является амидом феназин-1-карбоновой кислоты, может быть получен синтетически [Takeda, 1958] из хлорорафина - изумрудно-зеленого пигмента, характерного для Р. chlororaphis, однако выделенного и из КЖ Р. aeruginosa [Kanner et al., 1978].
Было показано, что штаммы Р. aeruginosa, образующие геми- пиоцианин и оксихлорорафин, обладали более высокой антифун- гальной активностью в опытах по антагонизму [Takeda, 1959].
Способность к синтезу феназиновых пигментов свойственна и другим видам р. Pseudomonas. Феназин-1 -карбоновую кислоту способны синтезировать штаммы Р. putida, Р. fluorescens и Р. aeruginosa [Slininger, Shea-Wilbur, 1995; Slininger et al., 1996].
Исследованиям антибиотических свойств штамма Р. fluorescens 2-79, подавляющего развитие Gaeumannomyces graminis var. tritici (Ggt), поражающего пшеницу, посвящены работы M. Weller и L.S. Thomashow [1989, 1990]. Показано, что клетки Р. fluorescens 2-79 продуцируют антибиотик феназин-1-карбоновую кислоту, которая обнаруживалась у растений, выросших из семян, обработанных культурой псевдомонады [Thomashow et al., 1990], она также входит наряду с наиболее сильным антибиотиком 2-оксифеназин-1-карбоновой кислотой и 2-оксифеназином в состав пигментного комплекса Р. aureofaciens [Петренко, Боровков, 1970; Toohey et al., 1965].
Широкое распространение феназиновых пигментов у бактерий р. Pseudomonas, высокая активность их биосинтеза свидетельствуют о важной и пока окончательно не выясненной роли их в жизнедеятельности бактерий-продуцентов [Pierson L.S.P., Ш, Pierson Е.А., 1996; Chin-A-Woeng et al., 2003].
Комплекс антибиотиков ароматической природы был выделен из штаммов Р. aurantiaca [Киприанова и др., 1969, 1971] и параллельно из Р. fluorescens [Редди, Боровков, 1969], компоненты комплекса имели близкий химический состав, сходные УФ- и ИК-спектры [Есипов и др., 1975]. После разделения компонентов комплекса антибиотически высокоактивным веществом оказался 2,4-диацетилфлороглюцин. Этот антибиотик наряду с фенази- нами является одним из всесторонне изучаемых [Shanahan et al., 1992; Nowak-Thompson et al., 1994; Bonsall et al., 1997]. Это, по-ви- димому, обусловливается способностью Pseudomonas к образованию сложных многоядерных производных из более простых путем конденсации с помощью формальдегида подобно тому, как это происходит в химическом синтезе.
Можно отметить, что антибиотики ароматической природы встречаются у псевдомонад сравнительно редко [Смирнов и др., 1991; Nowak-Thompson et al., 1994], чего нельзя сказать о способности к синтезу азотсодержащих гетероциклических соединений.
К числу соединений, содержащих пиррольное ядро, относится антибиотик пиолютеорин, впервые выделенный из Р. aeruginosa [Takeda, 1959], но чаще всего встречающийся у Р. fluorescens [Mauerhofer et al., 1994].
Еще одно производное пиррола - пирролнитрин - является одним из самых мощных антифунгальных агентов, выделенных из бактерий р. Pseudomonas. Пирролнитрин впервые был выделен из КЖ Р. pyrrocynia [Arima et al., 1964]. Позже D. Livelly и др. [1966] пирролнитрин был обнаружен в КЖ Р. aureofaciens. В дальнейшем пирролнитрин был обнаружен и у других видов псевдомонад: Р. fluorescens, Р. cepacia [Burkhead et al., 1994].
В работе C.R. Howell, R.D. Stipanovic [1980] показано, что штамм P. fluorescens Pf-5 синтезировал два антибиотика - пирролнитрин и пиолютеорин.
Изолят Р. cepacia RB425 продуцировал ряд антибиотиков, которые оказались близкими пирролнитрину, 2-(2-гептенил)-3-ме- тил-4-хинолинолу и 2-(2-ноненил)-3-метил-4-хинолинолу. Обнаружена высокая активность очищенных соединений в отношении Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae. В то же время бактерицидная активность выделенного штамма была низкой [Homma et al., 1989].
Новые хлорированные фенилпиррольные антибиотики, выделяемые бактерией Р. cepacia, получены W.J. Janisiewicz, J. Roitman [1988]. Они представляли собой 2,3-дихлор-4-(2-амино- хлорфенил)-пиррол и 2-(2-гептенил)-3-метил-4(1Н)-хинолинон [Roitman et al., 1990]. Из другого штамма Р. cepacia RB425 были выделены антибиотики, близкие по строению к пирролнитри- ну, 2-(2-гептенил)-3-метил-4-хинолину и 2-(2-ноненил)-3-метил- хинолину [Roitman et al., 1990]; из штамма Р. cepacia PC II были выделены 2-пентил-3-метил-4-хинолинон, 2-гептил-З-ме- тил-4-хинолинон, 2-нонил-3-метил-4-хинолинон [Moon et al., 1996].
В 1981 г. К. Kintaka и др. сообщили о выделении из бактерий р. Pseudomonas антибиотика р-лактамной природы. Продуцент нового антибиотика сульфазецеина получил название Р. aci- dophila. Отличительной особенностью этого вида является способность к росту при низких значениях pH, что крайне редко встречается у псевдомонад. Сульфазецеин - водорастворимый антибиотик, содержащий серу, аланин, глутаминовую кислоту и представляющий собой 3(К)-Зу^-глютамин-амино-3-метокси- азетидин-2он-сульфоновую кислоту, позже было показано, что этот антибиотик обладает антифунгальной активностью.
Т. Paulitz и др. [2000] выделили из КЖ штамма Р. aureofaciens ( = Р. chlororaphis) 63-28 антибиотик бутиролактонной (фура- новой) природы - 3-(1-гексенил)-5-метил-2-(5Н)-фуранон или (г)-4-метил-2-(1-гексенил)-2-бутенолид , ранее у этого штамма были выделены еще два бутиролактона с антифунгальными свойствами - (г)-4-гидрокси-4-метил-2-(1-гексенил)-2-бутенолид и (Z)-4- гидроксиметил-2-(1-гексенил)-2-бутенолид [Gamard et al., 1997].
Новый антибиотик, обладающий фунгицидными свойствами, выделен у штамма Pseudomonas sp. Q38009 и представляет собой 15-членное макролактоновое кольцо с ответвлением метоксии- минной структуры [Suzumura et al., 1997].
Считалось, что способность к синтезу антибиотиков - полипептидов - у бактерий р. Pseudomonas распространена сравнительно слабо [Parker et al., 1984], но в последнее время это утверждение было опровергнуто.
У Р. cepacia АТСС 39277 обнаружена целая группа циклических пептидов, проявляющих антигрибные свойства, - ксилокан- дины Al, А2, Bl, В2, Cl, С2, D1 и D2 [Bisacchi et al., 1987; Meyers et al., 1987]. При помощи масс-спектрометрии определены их молекулярные массы (кДа): А1 - 1,215; А2 - 1,199; В1 - 1,229; В2 - 1,213; С1 - 1,097; С2 - 1,081; D1 - 1,083; D2 - 1,067. Каждый кси- локандин содержит глицин, серин, аспарагин (1-3 остатка), р-гид- рокситирозин и необычную аминокислоту с формулой C|8H37N05. Дополнительно компоненты Al, А2, D1 и D2 содержат 2,4-диаминобутановую кислоту, компоненты Al, Bl, С1 и D1 - эритро-р-гидроксиаспарагин, а ксилокандины Al, А2, В1 и В2 содержат еще и ксилозу. Для каждой пары ксилокандинов эритро-р-гидроксиаспарагин в первом компоненте пары таким образом заменен аспарагином во втором компоненте, что массовое различие для каждой пары составляет 16 Да.
Из другого штамма Р. cepacia AF 2001 корейскими учеными [Lee, 1994] выделен другой антибиотик пептидной природы - се- пацидин А, обладающий высокой антигрибной активностью и представляющий собой смесь двух очень близких по химической природе компонентов сепацидина А1 и сепацидина А2.
Штамм Р. cepacia ВС И продуцирует антибиотик AFC-BC11, отличающийся высокой антагонистической активностью [Kang et al., 1998].
Ранее отмечалось, что Pseudomonas sp. продуцирует также комплекс полипептидных антибиотиков - эльтерецидинов, подавляющих рост Alternaria [Kirinuki et al., 1977].
В последнее время появились сообщения о циклических ли- попептидах, обладающих фунгицидной активностью, - вискози- намиде, тенсине, амфизине, обнаруженных у Р. fluorescens [Nielsen N. et al., 1998; Nielsen T. et al., 2000], Pseudomonas sp. DSS73 [Sorensen et al., 2001].
W. Fakhouri и др. [2001] выделили из штамма Р. fluorescens G308 новое антибиотическое вещество, идентифицированное как М-меркапто-4-формилкарбостирил.
Из КЖ другого штамма Р. fluorescens ММ-В16 С. Lee и др.

[2003] выделили антибиотик аеругин, проявляющий антигриб- ную активность. Эмпирическая формула выделенного соединения C10HuNO2S, молекулярная масса 209,0513, по химической структуре 4-оксиметил-2-(2-оксифенил)-2-тиазолин.
Корейскими учеными во главе с К.К. Kim [2000] выделен другой антифунгальный антибиотик - N-бутилбензенсульфонамид.
Штаммы WH157 и WH161 Р. fluorescens, развивающиеся на семенах, корнях, гипокотилях и семядолях хлопчатника, синтезируют антибиотик оомицин А. Обработка семян хлопчатника штаммом WH157 стимулировала прорастание семян на 15-20% и снижала заражение всходов Pythium ultimum [Howie et al., 1989].
Другой класс антифунгальных метаболитов псевдомонад - это экзоферменты (хитиназы и глюконазы). Так, наличие у некоторых псевдомонад комплекса гидролитических ферментов определяет их способность использовать в качестве источника питания грибной мицелий.
Изучена хитинолитическая активность у 235 изолятов различных видов Pseudomonas, отнесенных к комплексу Р. fluorescens и Xanthomonas maltophilia, близких к Pseudomonas. Способность к образованию хитинолитических ферментов выявлена лишь у отдельных штаммов Pseudomonas, в то время как у большей части штаммов (33 из 41) X. maltophilia хитинолитическая активность обнаружена [Andreeva et al., 1996].
В коллекцию микроорганизмов В КМ депонирован штамм Р. maltophilia ТС-259, обладающий хитинолитической активностью. Данный штамм обладает способностью подавлять рост фитопатогенных грибов-возбудителей сосудистых увяданий и корневых гнилей растений [Пат. РФ 2031119].
Анализ ферментативной активности группы штаммов р. Pseudomonas выявил у штамма SPB2142 способность к продуцированию хитиназы. При изучении антифунгальной активности бактерий подтвердилось, что данный штамм обладает способностью использовать грибной мицелий как источник питания [Кравченко и др., 2002].
На основе Тп 7 была сконструирована система, несущая chiA ген Serratia marcescens под контролем Рис-промотора в составе плазмиды pUXH21. В трехродительском скрещивании pUXH21 была передана в Р. fluorescens, в результате чего получили штамм, стабильно экспрессирующий и секретирующий активную хитиназу. Сконструированный штамм обладал биологической активностью против почвенного растительного патогена Rhizoctonia solani [Simi Body et al., 1994].
Большинство авторов сообщает о способности штаммов Az, chroococcum продуцировать антифунгальные антибиотики, но в литературе практически нет сведений о химической природе этих веществ. В единственном источнике сообщается о штамме Az, chroococcum 92, синтезирующем на среде с мелассой антифун- гальный антибиотик, представляющий собой метиловый эфир алифатической тетраеновой кислоты. Антибиотик угнетал рост фитопатогенных грибов Helminthosporium sativum, Botrytis cinerea, Verticillum dahliae, Fusarium sp. [Пат. 922105]. Из культуральной жидкости штамма Azotobacter chroococcum 53 Е.Н. Мишустиным и др. [1969] был выделен антибиотик, сходный по структуре с анисомицином, но отличающийся от последнего по УФ-спектру, поэтому был сделан вывод о выделении нового антибиотика, ранее не описанного в литературе. Антибиотик угнетал рост фитопатогенных и фитотоксичных грибов родов Aspergilus, Penicillium, Alternaria, Fusarium.
Реже в литературе сообщается о способности бактерий р. Azotobacter продуцировать биологически активные вещества группы сидерофоров, которые подавляют рост фитопатогенов путем конкуренции с ними за железо [Suneja et al., 1993, 1996].
Таким образом, у бактерий р. Pseudomonas в отличие от представителей Azotobacter наиболее широко изучены свойства, характеризующие способность подавлять или замедлять рост почвенных фитопатогенов. Механизмы антагонистических взаимодействий псевдомонад и фитопатогенов различны. Это продукция сидерофоров, отвечающих за связывание и транспорт железа и синтез антибиотических веществ. Нам представлялось наиболее интересным изучить вторичные метаболиты как псевдомонад, так и азотобактера, с точки зрения их антагонистической активности к фитопатогенам. Для этого были апробированы разработанные нами схемы выделения и очистки метаболитов, обладающих фунгицидной активностью.
Широкая распространенность Pseudomonas обеспечивается их способностью развиваться в самых различных условиях в природе, в широком интервале температур и использовать самые разные соединения углерода и азота в энергетическом и конструктивном обмене [Рубан, 1986; Corbell, Loper, 1995]. Но для культивирования Pseudomonas с целью получения антибиотических веществ, как правило, требуются богатые органическими формами азота и углерода среды.
Е.О. King и др. [1954] предложили среду для определения образования флюоресцирующих пигментов; в дальнейшем и до наших дней эта среда Кинг В, в состав которой входят глицерин, пептон, K2HP04, MgS04, является одной из основных для культивирования Pseudomonas - продуцентов веществ с фунгицидной активностью. Реже используются также богатые среды - такие как среда LB и питательные бульоны с добавлением 0,5-1,0% источника углевода (обычно глюкозы) [Katoh, Iton, 1983; Gould et al., 1985; James, Gutterson, 1986]. Однако, как показано в работе Е.И. Квасникова и др. [1975], штаммы Р. aurantiaca способны к синтезу веществ с фунгицидной активностью не только на богатой среде Кинга, но и на синтетической среде Мюнца в присутствии низкомолекулярных н-алканов (С8-С10).
Достаточно хорошо изучен синтез антибиотиков феназино- вой природы на средах, где в качестве единственного источника углерода фигурировал н-алкан, что было показано для пиоциани- на [Поморцева, 1965], феназин-1-карбоновой кислоты (с октадеканом, гексадеканом, тетрадеканом) [Higashihara, Sato, 1969]. Т. Higashihara и A. Sato [1985] получили феназин-1-карбоновую кислоту из штамма Р. aeruginosa, источником углерода для которой служил этанол. Из работы Т. Ohmori и др. [1978] следует, что в значительных количествах синтезируется бактериями на средах с н-парафинами и пиолютеорин.
В.К. Duffy, G. Defago в своих работах [1997, 1999] показали влияние источника углерода и минерального состава питательной среды на биосинтез диацетилфлороглюцина, пиолютеорина, пирролнитрина и сидерофора пиохелина, продуцируемых штаммом P.fluorescens CHAO. Секреция флороглюцина стимулировалась наличием в питательной среде ионов Zn+2, NH4Mo+2 и глюкозы, биосинтез пиолютеорина стимулировался ионами Zn+2, Со*2 и глицерином, но в то же время подавлялся глюкозой, а выход антибиотика пирролнитрина увеличивался на средах с фруктозой, маннитолом в присутствии смеси ионов Zn+2 и NH4Mo+2, синтез же сидерофора пиохелина стимулировался ионами Со*2 и источниками углерода, такими как фруктоза, маннитол и глюкоза. Эти закономерности сохранялись и для других 41 штамма этого вида, менее продуктивных по количеству синтезируемых антибиотиков. В этой работе также показано, что неорганические фосфаты ингибируют синтез флороглицина, а секреция других антибиотиков уменьшается незначительно. Внесение в питательную среду таких ионов, как Cu+, Mn+2, Li+, Fe+2, Mg+2, Са+2, В+3, не играет значительной роли в биосинтезе.
Синтез феназиновых антибиотиков начинается в стационарную фазу роста. На среде с глицерином в качестве источника углерода, лейцином и аланином в качестве источников азота и определенным уровнем содержания магния и фосфора выход фена-

48 ч инкубации. Световая микроскопия. Увел. 400 (а, в, г, д); 1600 (б) а - контроль;
под воздействием метаболитов: б, д - Pseudomonas aureofaciens ИБ 6; в - Pseudomonas sp. ИБ 182; г - Pseudomonas aureofaciens ИБ 51

Рис. 4. Прорастание конидий и формирование мицелия Fusarium culmorum
48 ч инкубации. Световая микроскопия. Увел. 400 (а, в, г, д); 1600 (б)
а - контроль;
под воздействием метаболитов: б, д - Pseudomonas putida ИБ 56; в - Pseudomonas sp. ИБ 182; г - Pseudomonas aureofaciens ИБ 51

Рис. 5. Влияние штаммов азотобактера на развитие микромицета Bipolaris sorokiniana
а - Az. vinelandii ИБ 1; б - Az. vinelandii ИБ 3; в - контроль

Рис. 6. Влияние штаммов азотобактера на развитие микромицета Fusaruim culmorum
а - Az. vinelandii ИБ 1; б - Az. vinelandii ИБ 4; в - контроль

alt="" />
Рис. 13. Пространственная конфигурация молекулы триглицеридпептида псевдомонад

зинов достигает максимальной концентрации [MacDonald, 1967; Leisinger, Margraff, 1979]. Лимитирование фосфатами вызывает синтез феназинов. Низкий уровень фосфатов в конце экспоненциальной фазы является триггером синтеза феназинов. Повышение концентрации фосфатов останавливает синтез [Martin, 1977; Martin et al., 1992].
Большое влияние на синтез антибиотиков оказывает аэрация в процессе культивирования. Как правило, культивирование псевдомонад с целью получения антибиотиков фунгицидной природы проводят в течение 48-72 ч (исключение составляет синтез антибиотика аеругина - 6 сут) [Lee et al., 2003] при температуре 24-28 ° в условиях аэрации. И также, как правило, максимальный рост фунгицидной активности наблюдается в стационарную фазу.

<< | >>

Источник: о.н. логинов. БАКТЕРИИ Pseudomonasи Azotobacter как объектысельскохозяйственнойбиотехнологии. 2005

Еще по теме ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКАИ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАБОЛИТОВ,ОБЛАДАЮЩИХ ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ,ПРОДУЦИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ РОДОВ PSEUDOMONASИ AZOTOBACTER:

- Болотоведение - Метеорология и климатология - Научно-популярная история - Океанология (океанография) - Почвоведение -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -