Изучение ассимилятивных свойств грибов рода Malassezia по М. Crespo [58].

Ассимиляцию источников липидов изучали при посеве культур на среду для изучения ассимиляционных свойств дрожжевых грибов (Yeast nitrogen base, Himedia, Индия). В агаровой пластине застывшей среды делали лунки

о

диаметром 1 см, куда вносили соответствующие субстраты в объеме 0,3 см - Твин-40, Твин-80 (производства Merk, Германия).

Определение концентрации клеток в суспензиях культур грибов проводили путем подсчета грибных клеток в счетной камере Горяева [3].

Определение жизнеспособности грибных клеток. Готовили серийные разведения суспензии культур грибов в физиологическом растворе

12 3

1:10" , 1:10" , 1:10" ... и т.д. в зависимости от концентрации грибных клеток. Затем делали высев суспензии культуры на питательные среды в чашках

Л

Петри в объеме 0,5 см . Для посева брали по 4 пары чашек. После культивирования проводили количественный учет выросших грибных колоний. Жизнеспособность грибных клеток определяли по формуле:

C=(K/V0)x, где К - степень разведения, V0- объем посевной дозы, х - среднее арифметическое сумм колоний, выросших на парных чашках. 2.1.13. Изучение вирулентных свойств грибов рода Malassezia. Определение LD50 культур грибов.

Культуры для заражения выращивали в пробирках на среде Барфатини при 37°С в течение 7 сут. По окончании культивирования готовили суспензии дрожжевых клеток в физиологическом растворе. Концентрацию дрожжевых клеток в полученных суспензиях определяли подсчетом в камере Горяе- ва. Из исходной суспензии каждого штамма готовили ряд разведений с кон-

¦j -1 о

центрацией дрожжевых клеток 200 млн/см , 500 млн/см , 1 млрд/см , 2

л о «5

млрд/см , 3 млрд/см , 4 млрд/см . Полученные разведения вводили животным внутрибрюшинно, в объеме 0,5 см .

При проведении опыта были соблюдены стандартные условия содержания, кормления и ухода для всех групп мышей.

Клинические наблюдения за животными проводились ежедневно, при этом фиксировали клиническое состояние и наличие падежа. Павшие мыши подвергались патологоанатомическому и микологическому исследованию. Для микологического исследования отбирали патматериал из кожных поражений, паренхиматозных органов, лимфоузлов и кишечника. Микологический анализ включал микроскопию патматериала и его посев на питательные среды: модифицированный агар Диксона, среду Барфатини с хлорамфенико- лом (OXOID), сусло-агар, сусло-агар с селективной добавкой Dermasel (цик- логексимид и хлорамфеникол) (OXOID). Культивирование проводилось при

температуре 37°С в течении 7-10 сут. При выделении из патматериала культуры гриба проводили ее идентификацию и сравнение с исходной культурой, использованной для заражения. Срок наблюдения за подопытными животными составил 25 сут.

По окончании опыта для оценки вирулентности культур грибов вычисляли показатель LD50 по методу Кербера в модификации Ашмарина (Методическое руководство по лабораторной оценке качества бактерийных и вирусных препаратов. М, Гос. Контрольный институт медицинских биологических препаратов им. JI.A. Тарасевича, 1972).

Определение вирулентности культур грибов методом накожного заражения проводили на беспородных собаках в возрасте 1-3 года, на момент проведения эксперимента клинически здоровых. Между лопатками выстригали и выбривали участок кожи площадью 5x5 см, обрабатывали 96° этанолом, скарифицировали скальпелем до появления гиперемии, не допуская травмирования кожного покрова. Взвеси грибных культур в физиологическом растворе наносили пипеткой на подготовленные участки кожи, втирали шпателем. Животным контрольной группы в качестве плацебо наносили физиологический раствор. Наблюдения за животными проводились ежедневно, включали общий клинический осмотр, оценку клинических изменений в очагах заражения, отбор патологического материала из очагов заражения для последующего микологического исследования. Наблюдения за животными продолжались вплоть до исчезновения клинических признаков.