1.4. Питательные потребности грибов рода Malassezia и условия для их культивирования

Разработка рецептуры питательных сред для культивирования грибов рода Malassezia базируется прежде всего на сведениях о питательной потребности этих микроорганизмов.

Длительное время считалось, что дрожжи рода Malassezia вообще не могут быть выделены в культуру, т.к.

Позже было установлено, что для роста грибов рода Malassezia необходимо наличие в питательной среде жирных кислот с длиной цепи С12-С24, которые грибы рода Malassezia не способны синтезировать самостоятельно. Эти компоненты встречаются в натуральных маслах - оливковом, кукурузном, соевом, подсолнечном. В качестве источника липидов также могут быть использованы олеиновая, арахидиновая, стеариновая, пальмитиновая кислоты и Твины [116].

Показано, что в процессе гидролиза оливкового масла образуются свободные жирные кислоты и этиловые эфиры. Значение синтеза этиловых эфи- ров дрожжами рода Malassezia пока не интерпретировано [120].

За исключением потребности в липидах, питательные потребности грибов рода Malassezia довольно ограничены. Они не нуждаются в микроэлементах, витаминах, электролитах, не способны ферментировать сахара. В качестве единственного источника азота они способны использовать соли аммония (NH4CI, NH4H2SO4, (NH4)2S04), однако не ассимилируют KNO3. Также дрожжи успешно ассимилируют мочевину, креатин, креатинин, практически все аминокислоты, за исключением цистеина [121].

У грибов рода Malassezia отсутствует потребность в углеводах, а в качестве единственного источника углерода могут выступать липиды. Тем не менее М. pachydermatis в качестве источников углерода может ассимилировать глюкозу, маннит, глюцит, в то время как лактоза и молочная кислота не ассимилируются.

В исследованиях Kiss G. [101] большинство штаммов М pachydermatis ассимилировали глюкозу, маннит, сорбит, пептон, но не ассимилировали этанол. Этот же автор обнаружил у некоторых штаммов потребность в никотиновой кислоте.

Представители М. pachydermatis способны расти в диапазоне рН 4,0- 8,0; при значениях рН 1,0-3,0 и 9,0-10,0 рост ингибируется. Существенных отличий в энергии роста при значениях рН 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 не обнаружено [117].

Грибы рода Malassezia растут в аэробных условиях, но также способны к росту при микроаэрофильных и анаэробных условиях [75].

R. Bond [40] сообщает, что добавление в атмосферу инкубирования 5- 10% диоксида углерода существенно стимулировало частоту выделения М pachydermatis на среде Сабуро.

Для культуральной диагностики грибов рода Malassezia различными авторами был предложен целый ряд питательных сред. В работе J. Leeming & F. Notman [105], в сравнительном аспекте были изучены среды, предложенные Faergmann & Fredriksson (1980), van Abbe (1964), Ushijima (1981), Leeming & Notman (1987). Наилучшие ростовые свойства проявила среда Лемин- га-Нотмана (Leeming & Notman), в состав которой входил бактериологический пептон, глюкоза, дрожжевой экстракт, бычья желчь, глицерол, глицеро- ла моностеарат, твин-60, цельное коровье молоко и агар-агар. Температурный оптимум культивирования посевов составлял 34°С, срок культивирования - 14 сут. Эта среда получила широкое распространение в диагностике

Malassezia-\m^QK\\]m. В частности, ее применяли J. Faergmann [75], М. Pechere [138].

- Blanco J. [31] сообщает, что при выделении грибов рода Malassezia от больных отитом собак, наилучшие результаты были получены при использовании колумбийского кровяного агара и среды MacConkey. Посевы инкубировали 24 ч. при 37°С. Эти же среды использовал М. Crespo [57].

М. Crespo [58] для выделения Malassezia spp. высевал материал параллельно на среду Leeming & Notman и среду Сабуро с добавлением оливкового масла (10 мл/л).

D. Morris [129] также использовал среду Сабуро, на поверхность которой помещалась капля оливкового масла. Ватный тампон с материалом из ушного прохода помещали в каплю масла, после чего смоченным в масле тампоном делали штрих по поверхности среды.

F. Bernardo [29] для первичного выделения Malassezia использовал дрожжевой мальт-агар (Yeast malt agar, YMA), с добавлением антибиотика хлорамфеникол (25 мг/мл). Посевы инкубировались при 37°С в течение 5-10 сут.

По данным R. Lorenzini [107], наилучшими ростовыми свойствами для М. pachydermatis обладает декстрозная питательная среда с добавлением 1,5% дрожжевого экстракта. Рост грибов обнаруживался уже через 24 ч., а жизнеспособность сохранялась до 3-х месяцев.

Многие авторы используют в своих исследованиях для выделения грибов рода Malassezia модифицированну среду Диксона (mDixon) [58, 114, 52, 147, 166, 37]. В состав среды входят мальтозный экстракт, пептон, бычья желчь, Твин-40, глицерин, олеиновая кислота и агар-агар. Температура культивирования - 32-37°С. М. Girao [94] считает эту среду оптимальной для длительного хранения (9 мес.) культур Malassezia spp.

Однако A. Nell [96] не удалось выделить М. sympodialis на кровяном агаре, агаре Сабуро и агаре Диксона. Культура гриба была получена только на среде Сабуро, обогащенной олеиновой кислотой.

Значительный интерес представляют попытки создания хромогенной питательной среды для экспресс-диагностики Malassezia-ияфешщй. Т. Ка- neko [167] модифицировал коммерческую хромогенную среду для выделения грибов рода Candida - CHROMagar Candida, включив в нее компоненты среды Леминга-Нотмана (LN) - бычью желчь, моностеарат глицерола и Твин-60. На этой среде (LN-CHROM) грибы рода Malassezia образовывали гладкие колонии от розового до темно-красного цвета. Ростовые свойства среды были эквивалентны таковым у среды Леминга-Нотмана. Причем модификация состава среды никак не отразилась на свойствах колоний грибов рода Candida, что делает ее пригодной для одновременной изоляции и идентификации как грибов рода Malassezia, так и Candida.

Итак, в настоящее время предложено несколько питательных сред для культивирования грибов рода Malassezia, однако среди авторов нет единого мнения, какая из них является оптимальной для рутинных диагностических исследований. Немаловажным фактором для повседневной диагностической практики является доступность среды, простота изготовления, стабильность ее состава.