2.2.1.1. Сравнительная оценка методов выявления грибов рода Malassezia на покровных тканях животных

В ходе исследования было апробировано несколько методов отбора патологического материала, используемых в ветеринарной микологии: 1) кожный соскоб с пораженного участка; 2) смыва; 3) контактных чашек («бакпе-

чаток»), 4) отбор пробы сухим ватным тампоном-зондом в стерильную пробирку; 5) отбор пробы с помощью коммерческого коллектора, включающего ватный тампон-зонд и пробирку с транспортной средой Эймса.

Результаты сравнительной оценки различных методов отбора патологического материала для выявления грибов рода Malassezia

Табл.

дрожжевых грибов в пробах требует дальнейшего изучения 6. Коллектор с тампоном- зондом и транспортной средой Удобный и доступный метод. Позволяет проводить отбор проб из труднодоступных участков тела. Позволяет проводить оценку плотности популяции дрожжевых грибов. Жизнеспособность дрожжевых грибов в пробах требует дальнейшего изучения Сравнительная апробация данных методов отбора патологического материала показала, что оптимальным для повседневного использования в ветеринарной практике является метод с использованием ватного тампона- зонда (сухого или с транспортной средой). Использование тампона-зонда удобно, позволяет проводить отбор проб из труднодоступных участков тела (в т.ч. из слухового канала), а при посевах проб на питательные среды возможна количественная оценка плотности популяции дрожжевых грибов. Кроме того, использование тампонов-зондов, изготовляемых промышленным способом, позволяет стандартизовать процедуру отбора патологического материала, что обеспечивает воспроизводимость и сопоставимость результатов микологического анализа.

С целью подбора оптимальной питательной среды для культивирования грибов рода Malassezia было проведено сравнительное изучение жизнеспособности 5 эпизоотических штаммов М. pachydermatis на различных питательных средах. Для посева готовили взвеси дрожжевых культур в физиологическом растворе и определяли концентрацию дрожжевых клеток в камере Горяева. Концентрация дрожжевых клеток у всех пяти культур была приведена к одинаковому значению - 50 млн. клеток в 1 см3. Посев проводили методом десятичных разведений с последующим подсчетом выросших колоний, что позволяло определить жизнеспособность культур грибов на различных питательных средах.

Были использованы наиболее доступные и распространенные микологические питательные среды: сусло-агар, среда Сабуро, среда Чапека; сусло- агар с добавлением селективной антибактериальной добавки хлорамфеникол, специализированные липид-содержащие питательные среды Барфатини и Диксона, а также среда ПД-2.

т.к. эта температура многими авторами признана оптимальной для роста грибов рода Malassezia [59, 66, 76]. Наблюдение за посевами проводили ежедневно, визуально отмечая начало роста грибных колоний.

Жизнеспособность эпизоотических штаммов М. pachydermatis на различных питательных средах

Табл. 2 Питательная среда № штамма М. pachydermatis М/а 12803 15003 15503 16103 16903 Барфатини млн/см3 36,0±1,7 41,0±3,3 39,0±1,3 33,0±4,7 37,0±0,7 37,7/3,03 С.ж.к. 72,0±2,4 82,0±7,6 78,0±3,6 67,0±7,4 74,0±0,4 74,4 Начало роста, сут. 2 1 1 2 2 Сусло-агар млн/см3 17,0±1,6 22,0±3,4 20,0±1,4 15,0±3,6 19,0±0,4 18,6/2,70 С.ж.к. 34,0±3,2 44,0±6,8 40,0±2,8 30,0±7,2 38,0±0,8 37,2 Начало роста, сут. 3 3 3 3 3 Сабуро млн/см-1 16,0±3,4 24,0±4,6 21,0±1,6 16,0±3,4 20,0±0,6 19,4/3,43 С.ж.к. 32,0±6,8 48,0±9,2 42,0±3,2 32,0±6,8 40,0±1,2 38,8 Начало роста, сут. 3 3 3 3 3 Сусло-агар + Хлф млн/см3 9,0±2,2 14,0±2,8 13,0±1,8 8,0±3,2 12,0±0,8 11,2/2,58 С.ж.к. 18,0±4,4 28,0±5,6 26,0±3,6 16,0±6,4 24,0±1,6 22,4 4 4 4 4 4 Диксона млн/см3 34,0±1,6 40,0±4,4 38,0±2,4 30,0±5,б 36,0±0,4 35,6/3,84 С.ж.к. 68,0±3,2 80,0±8,8 76,0±4,8 60,0±11,2 72,0±0,8 71,2 Начало роста, сут. 2 1 1 2 2 ПД-2 млн/см1* 20,0±1,8 25,0±3,2 24,0±2,2 17,0±4,8 / 23,0±1,2 21,8/3,27 С.ж.к. 40,0±3,6 50,0±6,4 48,0±4,4 34,0±9,6 46,0±2,4 43,6 Начало роста, сут. 3 3 3 3 3 Чапека Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет Примечание: «с.ж.к.» - содержание жизнеспособных клеток относительно общей концентрации клеток гриба; Млн./см3 - общая концентрация дрожжевых клеток; М - средняя арифметическая вариационного ряда; а - стандартное отклонение вариационного ряда.

Как показывают представленные данные, наибольшую жизнеспособность культур М. pachydermatis обеспечивали липид-содержащие питательные среды Барфатини и Диксона (соответственно 67,0±7,4% - 82,0±7,6% и

Результаты определения жизнеспособности эпизоотических штаммов М. pachydermatis на различных питательных средах представлены в таблице 2.

60,0±11,2% - 80,0±8,8% жизнеспособных клеток).

Жизнеспособность М. pachydermatis на средах без липидов была статистически ниже, нежели на липид-содержащих средах. На среде Сабуро она составила 32,0±6,8% - 48,0±9,2% 0^=3,43 при fcm=2,13), на сусло-агаре 30,0±7,2% - 44,0±6,8% (fy,=9,01 при tcm=2,13). Показатели жизнеспособности М. pachydermatis на среде Сабуро и сусло-агаре статистически не отличались (^=0,08 при /с„г=2,13). Однако на среде ПД-2 жизнеспособность М. pachydermatis составляла 34,0±9,6% - 50,0±6,4%, что статистически сопоставимо с уровнем жизнеспособности на среде Барфатини (^=1,35 при /см=2,13).

Жизнеспособность культур М. pachydermatis сусло-агаре с добавлением хлорамфеникола составила 16,0±6,4% - 28,0±5,6% и была статистически ниже, нежели на сусло-агаре без селективной добавки (t(p=3,57 при /ст=2ДЗ).

Среда Чапека оказалась непригодной для культивирования М. pachydermatis.

Наиболее быстрое начало роста культур М. pachydermatis отмечали также на липид-содержащих средах Барфатини и Диксона - визуально рост колоний на этих средах наблюдали уже на 2-е сутки, а у отдельных штаммов - спустя 24 ч. после посева. На средах без источников липидов (сусло-агар, среда Сабуро, ПД-2), выраженный рост у всех штаммов отмечали на 3-е сут., а на среде с хлорамфениколом — только на 4-е сут. Морфологические признаки колоний (форма, цвет, рельеф, характер поверхности, строение растущего края) становились отчетливыми на 4-5-е сут. на липид-содержащих средах и на 6-7 сут. на средах без источников липидов.

Исходя из полученных результатов, в дальнейшем для выделения грибов рода Malassezia из патологического материала была использована среда Барфатини, являющаяся липид-содержащией модификацией среды Сабуро. В отличии от среды Диксона, таюке проявившей высокие ростовые свойства

для М. pachydermatis, среда Барфатини более доступна и проста в приготовлении, что делает ее более предпочтительной для повседневной лабораторной диагностики.

Однако недостатком данной среды является возможность роста конта- минантов, прежде всего бактериальных, что может исказить результаты микологического исследования.

В повседневной лабораторной практике большое влияние на объективность микологического анализа оказывают условия и сроки хранения патологического материала. При этом далеко не всегда имеется возможность приступить к культуральному исследованию образцов непосредственно после их отбора. Исходя из этого, была поставлена задача определить сроки, в течение которых жизнеспособность грибов рода Malassezia в образцах патматериала остается стабильной.

Пробы патологического материала отбирали с помощью ватного тампона-зонда в сухой коллектор и коллектор с транспортной средой Эймса. Отбор проб проводили от одного и того же животного с заведомым диагнозом Malassezia-отит. Было одновременно отобрано 5 проб в сухой коллектор и 5 проб в коллектор с транспортной средой Эймса, с соблюдением одинаковой методики отбора. Пробы хранились в холодильнике при 5-8°С, через определенные промежутки времени проводили высев образцов на питательную среду Барфатини с последующим учетом выросших колоний грибов рода Malassezia.

160 и

Результаты определения жизнеспособности Malassezia spp. в образцах патматериала, хранившихся в сухом коллекторе и в коллекторе с транспортной средой Эймса в течение 1, 2, 3, 5, и 7 сут. (рис. 1.)

0 Ч 1 1 1 1 1

исх. 12 3 7

срок хранения, суг.

—Сухой коллектор —с— Коллектор со средой Эймса

Рис. 1. Жизнеспособность грибов рода Malassezia в образцах патологического материала при различных условиях хранения

Установлено, что жизнеспособность Malassezia spp в образцах патматериала, хранившихся в коллекторах с транспортной средой Эймса, статистически не изменялась в течение всего срока хранения (^=0,07 при 4т=2ДЗ) и составляла 143,1±7,8 КОЕ, или 104,4±5,7%.

В образцах, хранившихся в сухих коллекторах, жизнеспособность Malassezia spp сохранялась на исходном уровне в течение первых 2 сут.

Таким образом, в условиях повседневной диагностической практики для отбора патматериала целесообразно использовать коллекторы с транспортной средой Эймса, обеспечивающие сохранность Malassezia spp. в образцах в течение длительного срока. При отсутствии коллекторов с транспортной средой, тампоны-зонды можно хранить в сухих коллекторах или лабораторных пробирках с пробкой, но в этом случае культуральный анализ необходимо провести в течение 2 сут. после отбора образцов патматериала.

В результате проведенных исследований был разработан алгоритм выявления грибов рода Malassezia в организме животных, оптимизированный для применения в повседневной диагностической практике.

животных

Предложенный алгоритм включает: 1. Отбор патологического материала с помощью ватного тампона-зонда с транспортной средой Эймса; 2. Посев патологического материала на питательные среды — Барфатини и Сабуро с хлорамфениколом; 3. Культивирование посевов в течение 5-7 сут. при 36°С; 4. При наличии роста грибов рода Malassezia - количественный учет выросших колоний (см. рис. 2). Полученные результаты позволили перейти к следующим этапам исследования.