2.2.3.2. Изучение цитоморфологических свойств клинических изолятов М. pachydermatis

Цитоморфологические свойства являются важнейшим дифференциальным критерием, позволяющим установить принадлежность дрожжевого гриба к роду Malassezia, а в ряде случаев определить его вид (в совокупности с физиологическими критериями).

Клетки овальные, эллиптические, с толстой оболочкой. Почкование бла- стоконидиального типа, монополярное, перкуррентное. Почкующиеся клетки по форме напоминают «отпечаток стопы». Дочерние клетки в основном такой же ширины, как и материнские. Псевдомицелий не формируется. Размер клеток 3,0-6,5 х 2,5 мкм.

Рис. 36. Микроморфология М. pachydermatis. Преобладают клетки овальной вытянутой формы. Увеличение х400

Рис. 35. Микроморфология М. pachydermatis. Увеличение х400

Хотя характерной формой клеток для М. pachydermatis является эллиптическая (рис. 36), у некоторых клинических изолятов М. pachydermatis преобладали клетки не эллиптической, а сферической формы (рисунок 37). Отмечено, что в популяции отдельных изолятов могут встречаться клетки обеих типов. Данная цитоморфологическая особенность этого вида должна учитываться при идентификации изолятов.

Рис. 37. Микроморфология М. pachydermatis. Преобладают клетки сферической формы. Увеличение х400 2.2.3.3. Изучение ферментативных и ассимилятивных свойств эпизоотических штаммов М. pachydermatis

У 32 эпизоотических штаммов М. pachydermatis была изучена способность к росту на среде без липидов, способность к ассимиляции Твин-40, Твин-80, способность к ферментации мочевины и цитрата и термотолерантность (способность к росту при 40С). Результаты исследований представлены в табл. 5.

Как свидетельствуют представленные данные, все изученные штаммы М. pachydermatis росли на среде Сабуро без липидов, ассимилировали Твин- 40 и Твин-80 (см. рис. 38), проявляли каталазную активность.

Рис. 38. Рост колоний М. pachydermatis на минеральной среде с добавлением Твин-40

2.2.3.4. Изучение чувствительности эпизоотических штаммов М. pachydermatis к антифунгальным препаратам

В терапии Malassezia-инфекций ведущую роль играют фармацевтические антифунгальные препараты как местного, так и системного действия. От выбора оптимального антифунгального средства во многом зависит эффективность лечения заболевания. Исходя из этого, важное практическое значение имеет изучение чувствительности грибов рода Malassezia к антифунгальным препаратам.

В опыте было использовано 32 эпизоотических штамма Malassezia pachydermatis.

Результаты изучения чувствительности штаммов Malassezia pachydermatis. к набору антимикотиков представлена на рис. 39.

Рис. 39. Чувствительность эпизоотических штаммов Malassezia pachydermatis к различным антифунгальным препаратам

Установлено, что штаммы гриба Malassezia pachydermatis отличаются между собой по спектру чувствительности к антифунгальным препаратам. К нистатину было чувствительно наибольшее количество изученных штаммов (47,3%), к тербинафину - 42,1%. Наименьшую активность проявил амфотерицин В - он ингибировал только 16,7% штаммов гриба Malassezia pachydermatis. Клотримазол и флюконазол ингибировали соответственно 27,4% и 24,2% изученных штаммов.

2.2.3.5. Изучение вирулентных свойств эпизоотических штаммов М. pachydermatis

На сегодня среди исследователей нет единого мнения в отношении па- тогенности грибов рода Malassezia, и в частности М. pachydermatis. Большинство авторов разделяет точку зрения, что патогенность этих грибов носит оппортунистический характер, т.е. проявляется только при наличии условий,

в той или иной мере ослабляющих защитные функции макроорганизма (D. Morris).

Попытки экспериментального воспроизведения Malassezia-инфекций у животных, описанные в литературе, были немногочисленными, их результаты носят противоречивый характер. Возможно, это обусловлено тем, что штаммы, составляющие в естественных условиях популяцию М. pachydermatis, могут отличаться по степени патогенности, аналогично другим видам патогенных грибов. Методы, использованные при изучении патогенности М. pachydermatis, также существенно варьировали у разных авторов [64, 115, 41].

В доступной литературе мы не смогли найти данные по определению вирулентности (LD50) М. pachydermatis при парентеральном заражении лабораторных животных. Вместе с тем данный информативный метод с успехом используется при изучении болезнетворных свойств других дрожжевых грибов (в частности рода Candida). Исходя из этого, была поставлена задача провести сравнительное определение LD50 ряда эпизоотических штаммов М. pachydermatis, выделенных из различных источников (от здоровых животных и животных с различными клиническими проявлениями Malassezia- инфекций). В случае получения информативных результатов, планировалось использовать наиболее вирулентный штамм М. pachydermatis для экспериментального воспроизведения Malassezia-дерматита у собак.

Внутрибрюшинное заражение белых мышей с последующим расчетом LD50 проводили общепринятым методом, также учитывая сроки гибели животных, патологоанатомические изменения, и результаты микологического анализа патматериала от павших животных. Содержание дрожжевых клеток составляло 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 4,0 млрд. в заражающей дозе. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор.

Результаты LD50 эпизоотических штаммов М. pachydermatis методом внутрибрюшинного заражения представлены в табл. 6.

Определение LD50 эпизоотических штаммов М. pachydermatis № штамма Источник Происхождения Показатель Заражающая доза, млрд/см'1 LDso, млрд 0,2 0,5 1 2 3 4 12803 Собака, больная Malassezia- отитом Кол-во животных 5 5 5 5 5 5 1,62 Из них пало - - - - 1 4 Выделена субкультура н/о н/о н/о н/о + + 15003 Собака, больная Malassezia- дерматитом Кол-во животных 5 5 5 5 5 5 1,41 Из них пало - - - 1 2 2 Выделена субкультура н/о н/о н/о + + + 15503 Слуховой канал здоровой собаки Кол-во животных 5 5 5 5 5 5 2,10 Из них пало - - - - 1 2 Выделена субкультура н/о н/о н/о н/о + + 16103 Собака, больная Malassezia- отитом Кол-во животных 5 5 5 5 5 5 2,45 Из них пало - - - - - 2 Выделена субкультура н/о н/о н/о н/о н/о + 16903 Собака, больная Malassezia-

отитом Кол-во животных 5 5 5 5 5 5 1,86 Из них пало - - - 1 2 4 Выделена субкультура н/о н/о н/о + + + Контроль Кол-во животных 5 5 5 5 5 5 - Клинически экспериментальная инфекция у мышей проявлялась апати

ей, анорексией, проявлением зуда кожного покрова, появлением алопеций. Гибель животных в большинстве случаев отмечалась на 2-7 сутки после инъекции культуры. У павших животных отмечены обширные алопеции, локализовавшиеся в области головы и спины. При вскрытии отмечены следующие патологоанатомические изменения: некротические очаги в селезенке, печени, сильная отечность брыжейки с кровоизлияниями, брыжеечные лимфоузлы увеличены.

В результате микологического анализа от всех павших мышей выделены субкультуры штаммов Malassezia pachydermatis, использовавшихся для экспериментального заражения.. Таким образом установлена патогенность всех пяти изученных штаммов для мышей при парентеральном введении.

Установлена разнородность изученных штаммов М. pachydermatis по

степени патогенности - LD50 варьировала от 1,41 до 2,45 млрд. клеток/доза. При этом не было обнаружено взаимосвязи степени патогенности и источником происхождения штамма. Так, вирулентность штамма М. pachydermatis 15503 от здоровой собаки, вопреки предположениям, не оказалась самой низкой. Клиническая форма Malassezia-инфекции (отит или дерматит) в данном опыте также не коррелировала со значением LD50. Данный опыт продемонстрировал наличие патогенных свойств у М. pachydermatis при внутрибрю- шинном введении. Для дальнейшего изучения патогенности М. pachydermatis методом накожного заражения был отобран штамм №15003, проявивший наибольшую вирулентность.

Метод накожного заражения широко применяется в экспериментальной микологии для оценки вирулентности патогенных грибов, прежде всего дерматофитов. Применительно к М. pachydermatis данный метод использовался в единичных экспериментах [41]. В качестве подопытных животных были использованы собаки - животные, наиболее подверженные Malassezia- инфекциям.

Заражение осуществляли общепринятым методом, нанося взвесь дрожжевых клеток на выстриженный и скарифицированный участок кожи животных. Клиническое наблюдение за животными проводилось ежедневно, до полного исчезновения клинических признаков в очагах заражения. Периодически отбирали патологический материал для дальнейшего микологического анализа. Результаты накожного заражения собак культурой М. pachydermatis представлены в табл. 7, результаты микологического анализа патматериала, отобранного из экспериментальных очагов — в табл. 8.

Изучение вирулентности штамма М. pachydermatis 15003 при накожном

заражении собак № жив. Сроки наблюдения 1 сут. 2 сут. 3 сут. 4 сут. 5 сут. Клинические признаки в очагах заражения 1 Гиперемия Гиперемия, Сливающиеся Слабая ги Слабая ги Единичные корочки, покры перемия, перемия, светло- вающие всю по фрагменты отдельные коричневые ко верхность очага корочек и чешуики, рочки, чешуики чешуек рост нового волоса 2 Гиперемия, Гиперемия, Сливающиеся Слабая ги Слабая ги слабое ше Единичные корочки на всей перемия, перемия и лушение светло- поверхности единичные шелуше коричневые ко очага, папулы корочки ние, рост рочки, папулы нового волоса 3 Слабая гиперемия Клинические признаки не отмечены Клинические признаки не отмечены Н/о Н/о контроль Слабая гиперемия Клинические признаки не отмечены Клинические признаки не отмечены Н/о Н/о Клинические проявления дерматита в очагах заражения наблюдали у 2

из 3 собак. Патологический процесс носил кратковременный характер, максимальная интенсивность клинических признаков наблюдалась у обоих заболевших животных на 3-е сутки после заражения. Табл. 8 № животного Кол-во посеянных образцов / кол-во выделенных субкультур Сроки наблюдения 3 сут. 4 сут. 5 сут. 6 сут. 1 15/11 15/7 15/2 15/0 2 15/9 15/8 15/3 15/0 3 15/1 15/0 Н/о Н/о Выделение субкультур М. pachydermatis из очагов экспериментального заражения в течение срока наблюдения

Клиническая картина демонстрировала наличие умеренного вос

палительного процесса, сопровождающегося гиперемией, шелушением, образованием сухих корочек (сквамозный дерматит) (рис. 40). Уже на следую- щий день началось очищение экспериментальных очагов, а на 6-е сутки клинических признаков в очагах заражения не обнаруживали.

Рис. 40. Клиническая картина экспериментального дерматита у собаки, вызванного накожным заражением культурой М. pachydermatis

Из экспериментальных очагов заболевших животных удавалось выделить субкультуры М. pachydermatis на 3, 4 и 5 сут. после заражения, причем на 5-е сут. выделяли лишь единичные колонии гриба. Выделение субкультуры от животного №3, не проявившего клинических признаков, вероятно, обусловлено тем, что на коже в течение 3-х сут. сохранились остатки иноку- лята гриба, использованного для заражения.

В результате эксперимента удалось воспроизвести у собак Malassezia- инфекцию в форме умеренного сквамозного дерматита, однако заболели не все подопытные животные, заболевание носило кратковременный характер и разрешилось самовыздоровлением.