Нитрогеназная активность штаммов псевдомонади азотобактера

Изучение особенностей биологической азотфиксации имеет большое значение для функционирования наземных экосистем. Растения потребляют, в основном, почвенный азот, причем даже в том случае, когда в почву вносятся высокие дозы минерального азота.

Целью наших исследований было изучение нитрогеназной активности выделенных штаммов псевдомонад и азотобактера.

Определение нитрогеназной активности штаммов проводили методом, основанным на восстановлении ацетилена [Методы..., 1984, Умаров, 1986].

Исследуемые микроорганизмы родов Pseudomonas и Azotobacter культивировали на среде Эшби с добавлением следов Na2Mo04 • 2Н20 в условиях аэрации.

Нитрогеназную активность бактерий р. Pseudomonas определяли через 72 ч культивирования. Активность фермента нитрогеназы бактерий р. Azotobacter определяли на 48-м и 72-м часах роста культур. Также для азотобактера нитрогеназная активность была определена на среде Берка [Рубенчик, 1960], на среде 40 с использованием в качестве источников углеродного питания глюкозы, сахарозы, калия виннокислого, натрия уксуснокислого.

По результатам проведенных экспериментов установлено, что на агаризованной среде Эшби хорошо растут штаммы Р. aureofaciens ИБ 51 и Р. aureofaciens ИБ 6. Следует отметить, что при росте на безазотистой среде данные микроорганизмы не образуют характерного ярко-оранжевого пигмента. В то же время было показано, что наибольшей ацетиленредуктазной способностью в жидкой культуре обладает штамм Pseudomonas sp. ИБ 182, который характеризовался слабым ростом при выращивании на плотной среде Эшби (табл. 12).

Таким образом, для штамма Pseudomonas sp. ИБ 182 выявлено наличие азотфиксирующей активности. Причем нитрогеназная активность штамма (0,43 мкг Г^мл/ч) сопоставима с аналогичной характеристикой для бактерий р. Azotobacter - типичных представителей азотфиксирующих микроорганизмов [Пат. РФ 2074159]. Штамм Pseudomonas species ИБ 182 запатентован в качестве продуцента хитинолитических ферментов [Пат. РФ 2187553].

Для изучения азотфиксирующей способности выделенных нами штаммов бактерий р. Azotobacter были поставлены эксперименты по определению нитрогеназной активности в условиях in vitro в жидкой культуре [Пугачева и др., 2004]. В эксперименте использовали также два штамма, полученные из ВКМ (Az. vinelandii В-1617, Az. chroococcum В-1616).

При определении нитрогеназной активности в жидкой культуре было установлено, что ее величина не зависела от температуры культивирования штаммов азотобактера и была одинаковой при 25° и 35° (табл. 13). При культивировании смешанной культуры нитрогеназная активность была значительно выше, чем у отдельных штаммов в аналогичных условиях, что согласуется с данными некоторых авторов [Умаров, 1986; Белимов, Кожемяков, 1992]. Кроме того, эта зависимость прослеживалась при росте на всех испытуемых источниках углерода.

Мы выявили лишь незначительную разницу в величине нитрогеназной активности при выращивании культур на таких источниках углеродного питания, как маннит, сахароза и глюкоза (табл. 14). Величина фиксации азота при росте на глюкозе была несколько ниже, чем при росте на сахарозе и манните. Поэтому при дальнейшем культивировании штаммов азотобактера, прежде всего, необходимо ориентироваться на источник углерода, на котором достигается высокий выход биомассы и который не относится к дорогим субстратам. Мы выбрали в качестве такого источника сахарозу, поскольку при выращивании на среде с использованием 10 г/л сахарозы в качестве источника углеродного питания большинство штаммов при температуре 23° достигали за 48 ч культивирования численности 108 КОЕ/мл КЖ, причем нитрогеназная активность в данном случае была высокой для всех штаммов.

Таблица 13.

Таблица 14. Величина нитрогеназной активности штаммов р. Azotobacter при выращивании на среде 40 с сахарами

Таблица 15. Нитрогеназная активность штаммов р. Azotobacter при выращивании на среде 40 с солями органических кислот в качестве источника углерода

Крайне незначительное повышение нитрогеназной активности (или ее отсутствие) при увеличении титра объясняется природой процесса азотфиксации. Микроорганизмы р. Azotobacter, фиксируя молекулярный азот, выделяют в среду азотсодержащие соединения (аминокислоты, аминосахара, аммонийный азот), а, как известно, наличие в среде любых форм азота ингибирующе действует на процесс азотфиксации [Умаров, 1986]. Поэтому в дальнейшем в качестве азотного питания клетки потребляют накопленный в среде азот, не затрачивая энергию на фиксацию азота. Интересные результаты получены при культивировании микроорганизмов на солях органических кислот. При относительно высоком титре клеток 105-106 КОЕ/мл величина нитрогеназной активности оказалась на порядок ниже, чем при выращивании на сахарах (табл. 15).

Таким образом, для всех трех выделенных штаммов Az. vinelandii была изучена интенсивность азотфиксации в зависимости от источника углеродного питания, времени и температуры культивирования. Было отмечено, что максимальная величина нитрогеназной активности приходится на период экспоненциальной фазы развития культур и не зависит от количества жизнеспособных клеток в среде. Величина нитрогеназной активности при росте на сахарозе и манните была в 1,3 раза выше, чем при культивировании на глюкозе и в 8,8 раз выше при росте на солях органических кислот.

Определение величины усваиваемого азота в смешанной культуре, состоящей из трех штаммов азотобактера, показало, что при росте на всех используемых источниках углерода азот- фиксация смешанной культурой в 1,2 раза превышает способность к фиксации азота у чистых культур.