Особенности антагонистического действия  штаммов псевдомонад и азотобактерана фитопатогенные грибы

Задачей исследования было изучить влияние, которое оказывают выделенные штаммы псевдомонад и азотобактера на рост и развитие различных фитопатогенных грибов.

Анализ данных, полученных при снятии спектра антагонистической активности штаммов-антагонистов, показал, что

Bipolaris sorokiniana среди исследованных фитопатогенных мик- ромицетов для всех культур-антагонистов является наиболее чувствительным тест-объектом (см.

Морфологические изменения, происходящие с фитопатогенными грибами под воздействием метаболитов пггаммов-антаго- нистов родов Pseudomonas и Azotobacter, изучали в условиях совместного роста микромицетов и бактерий на плотных средах ГПА либо КГ А. Наблюдения за развитием микроорганизмов проводили под микроскопом марки AMPLIVAL 30-G048-1 (“Carl Zeiss”, Германия) после инкубации в течение 48 ч.

В условиях непосредственного взаимодействия со штаммами псевдомонад и азотобактера формирование мицелия всех тест- грибов значительно замедлялось по сравнению с контролем (задержка прорастания спор на 24-96 ч), а формирующийся мицелий патогенов отличался ярко выраженными морфологическими изменениями. Так, под воздействием метаболитов нггам- мов-антагонистов происходило ограничение развития ростковых трубок с формированием на кончиках растущих гиф сферопла- стов. Нарушения в развитии гиф приводили в свою очередь к формированию излишне разветвленного, часто септированного мицелия, напоминающего нитку бусин (см. рис. 3-7; см. цв. вкл.). Сходный эффект наблюдали и другие исследователи при изучении воздействия бацилл-антагонистов на фузарии [Мелентьев, Галимзянова, 1999; Широков и др., 2002].

При совместном культивировании штаммов-антагонистов и фитопатогенных грибов на чашках Петри были отмечены особенности формирования колоний микромицетов. При этом необходимо подчеркнуть, что степень воздействия на фитопатоген определялась радиальным градиентом концентрации метаболитов бактерий-антагонистов: вне зоны действия веществ формировался обычный мицелий гриба, а чем ближе к колонии бактерии, тем ярче были выражены аномалии в строении мицелия.

Для грибов Fusarium gibbosum, F. oxysporum, F. semitectum, F. solani при культивировании с бактериями родов Pseudomonas и Azotobacter было отмечено развитие колоний только в виде субстратного мицелия; ускорение процесса спорообразования было выявлено для Fusarium graminearum (табл. 17, 18).

Таблица 17. Воздействие биологически активных веществ, выделяемых штаммами псевдомонад на развитие тест-грибов

Таблица 18. Влияние штаммов-антагонистов р. Azotobacter на развитие тест-грибов

Изучение воздействия метаболитов штаммов-антагонистов Az. vinelandii на развитие фитопатогенных грибов показало, что характер изменений в морфологии мицелия фитопатогенов сходен с реакцией микромицетов на метаболиты псевдомонад (см. рис. 3-7; см. цв. вкл.).

Как видно из рис. 5 (см. цв. вкл.), мицелий Bipolaris sorokini- ana, формирующийся под воздействием метаболитов Az. vinelandii ИБ 1, Az. vinelandii ИБ 3, характеризуется заметными морфологическими особенностями - увеличение объема, уменьшение длины, учащение образования септ, зернистость клеточного содержимого. При воздействии на грибы р. Fusarium к указанным эффектам прибавляется и отделение клеточного содержимого от стенок (рис. 6, 7; см. цв. вкл.). Различия в реакции грибов на воздействия метаболитов связаны, очевидно, с особенностями строения клеточных стенок. Bipolaris sorokiniana относится к темноокрашенным грибам (Dematiaceae), в состав клеточных стенок которых входит меланин, способный выполнять протекторные функции [Carlile et al., 2001].

Проведенные исследования позволяют предположить, что антигрибные метаболиты изученных штаммов-антагонистов родов Pseudomonas и Azotobacter, хотя и являются различными соединениями, тем не менее обладают сходным механизмом воздействия на развитие мицелия фитопатогенных грибов. Основной мишенью служит, очевидно, процесс синтеза клеточной стенки.

Хорошо известно, что один из основных механизмов биологического контроля, используемых псевдомонадами, заключается в их способности к образованию сидерофоров-пигментов, обладающих сродством к трехвалентному железу [Campbell et al., 1986; Loper, 1988; Comelis et al., 1990]. В литературе встречаются также сообщения о способности бактерий р. Azotobacter продуцировать биологически активные вещества группы сидерофоров [Suneja, Lakshminarayana, 1993; Suneja et al., 1996].

Для того чтобы выяснить, обусловлен ли антагонизм выделенных нами штаммов псевдомонад и азотобактеров по отношению к фитопатогенным грибам конкуренцией за железо, необходимо было проверить антифунгальные свойства культур в условиях избытка данного макроэлемента.

Для исследования влияния железа на антифунгальные свойства выделенных штаммов псевдомонад и азотобактера сравнивали их антагонистическую активность на среде Кинг В в отсутствие железа и с добавлением 100 мкг/мл FeCl3 [Смирнов и др., 1990].

На чашках со средой Кинг В в присутствии железа было отмечено изменение внешнего вида колоний бактерий: колонии штаммов Р. putida ИБ 56, Р. putida ИБ 17, Pseudomonas sp. ИБ 182 приобрели коричневую окраску; у колоний штаммов Р. aureofa- ciens ИБ 51 и Р. aureofaciens ИБ 6 увеличилась интенсивность оранжевой пигментации. Внесение в среду железа подавляло синтез желто-зеленых флуоресцирующих пигментов псевдомонад.

В целом проведенные нами исследования показали (табл. 19), что антагонистическая активность выделенных штаммов не

Таблица 19. Влияние железа на антифунгальную активность штаммов псевдомонад и азотобактера

лимитируется присутствием железа в среде, т.е., по-видимому, антифунгальные свойства культур определяются синтезом не си- дерофоров, а веществ другой природы.

Известно, что у некоторых штаммов бактерий-антагонистов способность подавлять рост и развитие грибов-фитопатогенов связана с синтезом хитиназ [Пат. РФ 2031119; Кравченко и др., 2002].

Для определения хитинолитической активности выделенных штаммов р. Pseudomonas их выращивали на среде с 1,5% агара следующего состава (в г/л): дрожжевой экстракт - 0,5; (NH4)2S04 - 1,0; MgS04 • 7Н20 - 0,3; КН2РСgt;4 - 1,36; дистиллированная вода - 1 л. В качестве источника углерода в среду вводили коллоидный креветочный хитин в количестве 0,5%. Культивировали штаммы на чашках Петри при 28°.

Способность псевдомонад к синтезу хитинолитических ферментов определяли по наличию вокруг колонии бактерии зоны просветления мутной среды. Эффективность гидролиза хитина определяли по величине отношения диаметра зоны просветления мутной среды вокруг колонии к диаметру колонии (в мм/мм).

Для бактерий р. Pseudomonas наличие хитинолитической активности - достаточно редкое свойство [Andreeva et al., 1996]. Среди исследуемых штаммов псевдомонад способность к продуцированию хитинолитических ферментов была обнаружена только у штамма бактерий Pseudomonas sp. ИБ 182 ]Пат. РФ 2187553]. Хитинолитическая активность данной культуры составила 5,75 мм/мм. Однако на данном этапе исследований роль хитиназы, продуцируемой Pseudomonas sp. ИБ 182, в проявлении антагонистической активности данной бактерии до конца не выяснена.

Таким образом, анализ данных, полученных при снятии спектра антагонистической активности штаммов псевдомонад и азотобактера, показал, что выделенные изоляты активно подавляют развитие фитопатогенных грибов широкого круга, в числе которых основные возбудители корневых гнилей злаковых культур - Fusarium oxysporum, F. solani, F. avenaceum, Bipolaris sorokiniana, a механизм антагонистического действия изучаемых культур связан, по-видимому, с синтезом веществ антибиотической природы.