МЕТОДЫ АНАЛИЗА СООБЩЕСТВ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ

Самые современные методы микологических анализов до сих пор не позволяют оценить всю совокупность микроскопических грибов в наземных экосистемах, в том числе и в почвах, и определить функциональные отношения между ними.

Поэтому одной из основных причин сложности характеристики состава микроскопических грибов является опосредованность их описания при выделении на питательных средах. Практически при использовании этого метода происходит одновременный подсчет, как активного мицелия, так и спор отдельных видов грибов, находящихся в состоянии покоя (то есть одновременный учет «куриц и яиц»). В целом, «используя метод посева, можно идентифицировать то, что нельзя увидеть (in situ), в то время как прямыми методами наблюдения можно увидеть то, что нельзя идентифицировать» [Garrett, 1956]. Эта проблема остается актуальной и до сих пор.

Приемы выделения грибов, используемые для анализа почв, как одного из самых сложных местообитаний, могут применяться и при анализе других субстратов.

Методы выделения. В настоящее время методы изоляции почвенных грибов разделяют на прямые (перенос отдельных спор или мицелия на питательную среду) и непрямые методы. При использовании прямых методов грибы можно выделять с поверхности или из почвенных частиц, а также с любых субстратов (коры, семян, других растительных или животных материалов, находящихся в почве) непосредственно или после предварительной инкубации в условиях влажности в течение нескольких недель.

Основные непрямые методы, используемые для описания сообществ почвенных грибов, это: метод разведений или поверхностного посева, когда в обоих случаях используется почвенная суспензия, метод отмывки почвенных частиц и метод Уоркапа, когда выделение ведется из почвенных комочков. В методе разведений при помощи стерильной воды готовят серии разведений почвенной суспензии. Последующее поверхностное нанесение, при котором почвенная суспензия распределяется по поверхности питательной среды, методически - проще. Этот метод традиционно используется у нас в стране. Его основное неудобство в том, что быстро растущие грибы покрывают всю чашку. В модификации метода разведений, чаще используемого за рубежом, определенный объем конкретного разведения почвенной суспензии смешивают с определенным объемом питательной среды, которая имеет температуру около 40° С. Смесь наливают в чашки Петри и инкубируют. Цель этой модификации метода - получить рост отдельных колоний из спор или мицелия, которые могут быть выделены в чистые культуры. Метод разведений обычно используют для подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) в образце.

В зарубежных исследованиях для определения разнообразия грибных комплексов путем выделения на твердые питательные среды часто используют метод отмывки почвенных частиц (soil washing techniques) [Widden, Parkinson, 1975; Wicklow, Whittingham, 1978; Baath, 1988 и др.]. Целесообразность применения этого метода обосновывают тем, что при выделении методом разведений выделение грибов происходит преимущественно из спор, а также преувеличивается присутствие ряда анаморф аскомицетов и представителей Mucorales за счет их высокой способности к споруляции [Frankland, 1998].

При использовании техники Уоркапа очень небольшое количество почвы (5-15 мг), без предварительного суспензирования в воде, распределяют в расплавленной питательной среде в чашках Петри. У нас в стране чаще выделение проводят при нанесении небольших почвенных комочков на поверхность застывшей питательной среды. Простота этой техники делает ее подходящей для сравнения большого числа образцов.

Для изоляции грибов из почв обычно следует добавлять антибиотики, такие как хлорамфеникол, пенициллин или стрептомицин, или подкислять среду, для того чтобы сделать ее селективной для грибов и подавить бактериальный рост.

В каждом из вышеперечисленных методов рост колоний на питательных средах в чашках показывает присутствие грибов в какой-либо форме в почве. Однако не все микроорганизмы, присутствующие в образце, могут продуцировать колонии на чашке. Другая проблема описания грибных сообществ связана с тем, что в почве имеются представители разных эколого-трофических групп грибов. Поэтому применение различных селективных питательных сред может дать разное представление о составе почвенных грибных комплексов [Методы экспериментальной микологии, 1973; Методы ..., 1991]. Селективные среды используют для выделения специализированных по определенному субстрату групп грибов.

Видовое разнообразие отдельных трофических групп почвенных грибов может быть также выявлено при внесении различных субстратных приманок, например, целлюлозы, крахмала, хитина и др. [Методы экспериментальной микологии, 1973; Марфенина, 1987; Гузев, 1988; Методы..., 1991]. Однако при таком выделении выявляются более узкие по составу видов группы грибов.

Другие подходы используют, когда исследуют микроорганизмы, которые могут существовать в специфических условиях среды, например, при высоком уровне загрязнения. Для выявления таких грибов применяют питательные среды с добавками загрязнителей, например, тяжелых металлов, ксенобиотических веществ и т.п. Однако эти приемы далеко не всегда показывают выявление специфических групп, по сравнению с выделяемыми на стандартных питательных средах.

Селективные методы также могут быть основаны на свойствах организма, иных чем питание. Например, хитридиевые грибы могут быть изолированы при помощи кусочков стерильного целлофана, так как они единственные среди грибов имеют подвижные споры, являясь при этом целл юл ол итиками.

Метод изоляции может дать представление, но не в состоянии описать полный состав грибов в почвах. Метод является только шагом в понимании роли грибов в природных экосистемах. Списки выявленных видов не говорят нам о количестве мицелия, его метаболитической активности, реальном обилии различных видов, их форме и распределении внутри местообитаний. Другие методы направлены на то, чтобы представить, что грибы делают в почве in situ.

При прямом наблюдении in situ можно увидеть формы и объединения грибов в их местообитаниях, но крайне редко возможно идентифицировать их. При таких исследованиях могут быть использованы световой и электронный микроскопы. Для микроскопии отделяют кусочки заселенных грибами субстратов, а затем окрашивают. Такие подходы были использованы для исследования распространения грибов и бактерий на корнях растений. Микроскопическое наблюдение на поверхности может показать и взаимодействия между структурами, например, такие как взаиморасположение гиф на поверхностях.

Другим способом изучения является изоляция грибов контактным методом из почв или с листьев на поверхность стекла. Мицелий некоторых грибов дорастает до поверхности стекол, помещенных в почву. Стекла обычно оставляют на одном месте в течение нескольких недель, а затем вынимают и окрашивают (метод Росси-Холодного). Этот метод может показать присутствие в почвах мицелия базидиомицетов, идентифицируемого по наличию на мицелии пряжек, чьи культуры обычно теряются при выделении на агаровые среды.

Присутствие и распространение грибов на поверхности растений, могут анализироваться «методом отпечатков». Лист прижимается к поверхности агаровой среды, затем лист удаляют, а зараженную среду инкубируют в термостате.

Прямое наблюдение методами, описанными выше, дало достаточно много информации о месте грибов в природных местообитаниях. Таким образом, были выделены 6 общих типов жизненных форм микробов: одноклеточные и подвижные (некоторые бактерии, зооспоры, простейшие), одноклеточные ограниченные и неподвижные (некоторые бактерии, все дрожжи), ограниченные мицелиальные колонии, лимитированные соседством колонизируемых частиц (Penicillium, Streptomyces), диффузный мицелий, не ассоциированный с конкретными субстратами (,Streptomyces), мицелиальные тяжи и плазмодии, скученные на поверхности субстрата (Myxomycetes) [Carlile et al., 2001].

Молекулярные методы. Как указывалось выше, до последнего времени большинство грибов было идентифицировано только в том случае, если у них имелись спороношения. Эта ситуация была существенным препятствием для прогресса в экологии грибов, так как значительную часть своего жизненного цикла в природе грибы обычно находятся в виде мицелия. Так, базидиальные грибы могут продуцировать плодовые тела, а затем, после нескольких недель плодоношения, быть не идентифицируемы в течение нескольких лет. Тем не менее, в это период их мицелий может быть обилен и активен в почвах, играя жизненно важную роль в питании растений как грибной партнер в микоризных ассоциациях.

Выявление и идентификация грибов в их вегетативной (мицелиаль- ной) фазе - одна из основных проблем экологии грибов, которая менее разработана чем экология растений и животных. Можно представить себе насколько небольшой прогресс был бы сделан, если бы растения и животные были идентифицированы точно только при наблюдении процесса репродукции. Однако современные молекулярные методы исследований дают определенную возможность идентифицировать виды грибов в отсутствии спороношений и даже без наблюдаемого мицелия.

Сейчас ДНК технологии позволяют проводить прямое изучение генома организмов. Существуют основные различия в границах, в которых различные части генома меняются в процессе эволюции. Некоторые части генов настолько высоко консервативны, что части их сиквенсов могут быть идентифицированы для отдельных царств, в то время как существуют и участки, различающиеся на уровне индивидуальностей. Следовательно, исследуя соответствующие части генома, будет возможно различить желаемые таксономические единицы, например, царства, виды и клоны. Часть нуклеотидного генома, которая интенсивно использовалась в филогении, классификации и идентификации как грибов, так и других организмов - это рибосомальная ДНК (рДНК). В отличие от большинства других генов, рДНК гены сгруппированы в повторяющиеся совокупности копий вдоль хромосомы в количестве до 100 копий на совокупность.

Простые копии имеют гены трех РНК компонентов рибосом 28S, 18S и 5,8S РНК. 18S ген может быть использован для оценки взаимосвязей между царствами. 28S ген более вариабелен. Он был активно использован в классификациях от рода до филума. 5,8S ген был использован для идентификации групп грибов, таких как зигомицеты, аскомицеты и базидио- мицеты. Между 28S и 18S есть участок, в котором встроен 5,8S ген, называемый промежуточными транскрибируемыми спейсерами (ITS). ITS менее консервативны и обычно варьируют значительно между видами. И, наконец, есть не транскрибируемый интергенный спейсер (IGS), который пытаются использовать на специфическом уровне для распознавания рас и популяций [Carlile et al., 2001].

Примеры использования ДНК технологий, в первую очередь, могут быть даны при использовании участков ITS в распознавании отдельных таксонов грибов, включая виды. В этом определении используется ПЦР - полимеразная цепная реакция. Эта процедура революционизировала ДНК технологию, так как она позволила воспроизводить повторно отдельные части генома или «амплифицировать», пока не будет создана вся присутствующая ДНК. Полученная ДНК затем может быть сопоставлена с ITS ДНК для определения вида, из которого был получен образец. ДНК технология становится все более и более полезной для экологов, а характеристики последовательностей становятся более широко доступными. База данных ДНК сиквенсов растет настолько быстро, насколько новые данные могут быть объединены. Хотя это не исключает существенные сложности при использовании данного метода. Так, исследования выполненные этим методом показали весьма существенные отличия в разнообразии и составе идентифицированных таксонов грибов в сравнении с группировками грибов, которые были изолированы из тех же почв на питательных средах. Такие сложности могут определяться как методическими проблемами выделения ДНК из почв, так и недостаточностью сведений о молекулярных свойствах отдельных видов в имеющихся сейчас банках данных. В настоящее время в банках данных имеются сведения о молекулярных свойствах у всего около 20% от всех хорошо описанных видов грибов [Viaud et al., 2000]. Кроме того, многие помещаемые в банки данных результаты молекулярных анализов грибов не содержат хотя бы ориентировочных первичных сведений об их видовой принадлежности.

Для описания динамики популяций видов грибов, а иногда и для идентификации отдельных видов используют методы определения антител.

Флуоресцентные методы. Метод ELISA. Свойство животных организмов продуцировать специфические антитела к различным субстратам может быть использовано и для идентификации грибов, особенно в случаях, когда другие способы не приемлемы, например, когда развит только мицелий и отсутствуют морфологически идентифицируемые признаки гриба. В этом случае антитела к определяемым «грибам-мишеням» готовят стандартными иммунологическими приемами, включая получение сыворотки кроликов, предварительно инфицированных грибными антигенами. Антитела, продуцируемые животными в ответ на грибное заражение, затем могут использоваться для идентификации грибов и определения их количества в образцах, где имеются и другие виды грибов. При проведении анализа образец, содержащий гриб-мишень, экспонируют с полученными антителами, которые связываются со спорами гриба или его гифами.

Растворимые грибные антигены также могут быть определены при помощи одного из самых быстрых и дешевых современных методов анализа - ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). При нем используют вторичные антитела, распознающие наличие первичных кроликовых антител за счет наличия комплексов с окрашенными веществами. Молекулы маркеры могут содержать флуоресцирующий изотиоционат или ферменты, которые могут высвобождать краситель из окрашенного субстрата. Затем в систему добавляют какое-либо вещество, которое при взаимодействии с ферментом меняет окраску. Поскольку количество фермента пропорционально количеству антител к антигену, изменение окраски вещества-показатель наличия данных антигенов.

Основной источник ошибок в иммунологической технике - перекрестные реакции антител с другими грибами, иными, чем использованными в источнике антигена. Это может проявляться в результате присутствия различных типов молекул в грибном материале, использованном при инокуляции животных.

В перспективе для описания грибного разнообразия предполагаются комбинированные подходы с использованием как морфологических описаний изолятов, так и методов молекулярной биологии [Frisvad, 1994; Bills, 1995].