АНАЛИЗ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ ОСУШЕННЫХ ТОРФЯНЫХ ПОЧВ МЕТОДОМ FISH Е. В. Менько, И. К. Кравченко

vtymrj @gmail.com

Прямой микроскопический метод, основанный на использовании олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов, был применен для оценки количества метаболически активных бактерий и архей в торфяных почвах, осушенных для добычи торфа и использования в качестве сенокоса.

Введение

Болота и заболоченные местности широко распространены на территории России и занимают свыше 10 % ее территории, играя значительную роль в цикле углерода, постоянно обмениваясь с атмосферой потоками CO2 и СН4. Болота, являются одним из главных источников биогенного метана в атмосфере, образование которого связано с деятельностью метаногенных архей [1]. Регуляция поступления метана в атмосферу осуществляется за счет активности метанотрофных бактерий [2].

В последние годы для детекции микроорганизмов цикла метана в болотных почвах широко применяется метод FISH (fluorescence in situ hybridization). В болотных экосистемах он успешно был применен как для детекции метанотрофов [2], так и метаногенов [3]. В отличие от молекулярных методов, основанных на ПЦР-технологии, FISH позволяет учитывать численность активно метаболизирующих клеток, которые непосредственно вносят вклад в осуществление процесса цикла метана.

Антропогенное воздействие на торфяные болота нарушает баланс процессов, определяющих поглощение и эмиссию метана. До настоящего времени дискуссионным является вопрос о том, с чем связано аномально высокое выделение метана из элементов дренажной сети и объектов сельскохозяйственного использования осушенных торфяников.

Материалы и методы исследования

Отбор и фиксация образцов торфяных почв

Образцы торфяной почвы были отобраны в июле 2009 года с глубины 10-15 см на осушенной части Дубненского болотного массива в Талдомском районе Московской области (56°42' с.ш. 37°50' в.д.) на объектах режимных полевых исследований потоков парниковых С-газов [4], а также вегетационных модельных опытов, моделирующих стадии создания сенокоса на осушенной торфяной почве (табл. 1). После отбора образцы транспортировали в лабораторию при +4 оС. Часть образцов фиксировали также с помощью коммерческого раствора RNA Later и хранили до анализа при комнатной температуре.

Таблица 1

Описание образцов торфа, использованных в работе

В лаборатории образцы были обработаны ультразвуком в течение 2 минут при 95 % мощности (УЗДН-А, Россия). После отстаивания суспензии (1:10) в течение 5 минут, отбирали 2 мл супернатанта и 4 % параформальдегидом в соответствии с методикой [5].

Флуоресцентная in situ гибридизация. Гибридизацию препаратов с флуоресцентномечеными олигонуклеотидными зондами проводили в соответствии с методикой [5] при температуре 46 оС. Для детекции представителей домена Bacteria использовали смесь универсальных зондов EUB 338mix [6]; представителей домена Archaea - зонд ARC 915 [5]. Для специфической детекции метанотрофов I типа использовали смеси зондов М-84 и М-705, а метанотрофов II типа - зонд М-450 [7]. Олигонуклеотидные зонды, меченные красителем Cy3, синтезированы фирмой Синтол, Россия. Общую численность бактерий определяли окрашиванием препаратов раствором ДНК-специфичного красителя ДАФИ. Численность целевых клеток оценивали подсчетом количества гибридизованных с зондами клеток на микроскопе AxioImager D1 (Karl Zeiss, Германия), с использованием светофильтров Zeiss 20 для Су3-меченных зондов и Zeiss 49 для подсчета клеток, окрашенных ДАФИ, в 50 полях зрения микроскопа с последующим расчетом на 1 г образца.

Результаты и обсуждение

Результаты определения общего количества микроорганизмов (окраска ДАФИ), а также численности метаболически активных архей, эубактерий и метанотрофов приведены в табл. 2. Проведенные исследования показали, что общее количество бактерий в торфяных почвах исходного торфяника составляло 28 *107 клеток г-1 . В торфоразработках общее количество бактерий незначительно, но достоверно снижалось и составило 25 * 107 клеток г-1 в образцах основной поверхности и 27 * 107 клеток г-1в образцах дна канавы. В образцах сенокосного луга общее количество бактерий снижалось до 23 *107 клеток г-1.

Анализ с помощью зондов, специфичных для детекции метанотрофов I и II групп показал, что численность метанотрофов, относящихся к Alphaproteobacteria, на порядок превышала количество метанотрофов I группы, которое составляло во всех почвах от 0,2 до 0,7 *107клеток. Количество метанотрофов II группы от 2,3 до 4,7 * 107клеток. Отмечено снижение численности метанотрофов II группы в образцах торфоразработок и сенокоса.

Количество микробных клеток в образцах торфяных почв, определенное прямыми микроскопическими методами

Примечание.

Для образцов исходного торфяника и сенокоса была протестирована методика отбора проб в поле с использованием специального препарата (RNALater), который позволяет сохранять биологические объекты, содержащие РНК, при комнатной температуре в течение нескольких суток. Полученные результаты продемонстрировали перспективность этого приема для сохранения метаболически активных микроорганизмов в образцах торфяных почв и увеличении степени десорбции клеток с поверхности торфяных частиц.

Анализ образцов вегетационного опыта показал, что наблюдается значительное возрастание общего количества бактерий (особенно в варианте без растений). Доля активных бактерий примерно соответствует таковой для канавы сенокосного луга.

Нами была высказана гипотеза, что изменения гидрологических условий, рН, растительности, содержания доступных минеральных соединений углерода и азота определяет вариабельность как в активности, так и в составе метанотрофных и метаногенных сообществ. Антропогенное воздействие приводит к увеличению количества метаногенов и, возможно, увеличению их разнообразия. Напротив, для метанотрофных сообществ предполагается снижение, как количества, так и разнообразия бактерий. Полученные результаты экспериментальных исследований могут служить подтверждением этого предположения. В почвах торфоразработок, а также сенокоса возрастает количество архей, основную долю которых в торфяных почвах составляют метаногены. В то же время, количество метанотрофов снижается. Выявленные различия могут служить объяснением факта высоких значений потока метана в атмосферу из антропогенно-нарушенных объектов по сравнению с естественным болотом, выявленного ранее [4].

Выводы В торфяных почвах, используемых для добычи торфа и сенокоса, выявлено увеличение численности метаболически активных метаногенных архей и снижение численности метанотрофов. Это объясняет обнаруженное увеличение эмиссии метана из этих объектов по сравнению с естественным болотом.

Литература Galand P. E., Juottonen H., Fritze H., Yrjala K. Methanogen communities in a drained bog: effect of ash fertilization // Microb. Ecol. - V.49.- P. 209-217. Dedysh S. N., Derakshani M., Liesak W. Detection and enumeration of methanotrophs in acidic Sphagnum peat by 16s rRNA fluorescence in situ hybridization, including the use of newly developed oligonucleotide probes for Methylocella palustris. // Appl. Environ. Microbiol. - № 67. - Р. 4850-4857. Casper P., On Chim Chan, Furtado A.L.S., Adams D. Methane in an acidic bog lake: The influence of peat in the catchment on the biogeochemistry of methane // Aquat. Sci. - 2003. V.65. - P. 36-46. Чистотин М. В., Сирин А. А., Дулов Л. Е. Сезонная динамика эмиссии углекислого газа и метана при осушении болота в Московской области для добычи торфа и сельскохозяйственного использования // Агрохимия. - 2006. - №6.- С. 54-62. Stahl D.A., Amann R. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics // Development and Application of Nucleic Acid Probes / Eds. E. Stakebrandt and M. Goodfellow Chichester: Wiley. - 1991.- P. 205-248. Daims H., Bruhl A., Amann R., Schleifer K-H., Wagner M. The domain-specific probe EUB338 is insufficient for the detection of all Bacteria:Development of a more comprehensive probe set // Syst. Appl. Microbiol. - 1999. - V 22. - P. 434-444. Eller G., Stubner S., Frenzel P. Group-specific 16S rRNA targeted probes for the detection of type I and type II methanotrophs by fluorescence in situ hybridisation // FEMS Microbiol. Lett. - 2001. - V.198. - P.31-37.

FISH ANALYSIS OF MICROBIAL COMMUNITIES IN DRAINED PEAT SOILS

E. V. Menko, I. K. Kravchenko

The numbers of metabolic active bacteria and archea were evaluated in peatlands drained for peat extraction and hayfield by direct microscopy count with specific fluorescent probes. The number of archea was found to increased in drained peats, and alternatively number of methanotrophs decreased. Our findings may be useful to explain data of unusual high methane efflux from drained peatlands.

УДК 631.46