МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ВЗАИМООТНОШЕНИЙВ БИОТИЧЕСКОМ СООБЩЕСТВЕ

Антагонизм. Для выявления микробов-антагонистсв и изучения их антибиотической активности существуют различные методы Многие из них основаны на способности антибиотиков диффундиро вать в агаризованную среду.

Спектр антимикробного действия антагониста удобно определят с псмошью следующих методов. На питательный агар в чашки Петр высевают в виде прямого штриха испытуемый организм. К выросшее микроорганизму подсевают перпендикулярными штрихами тест-орг иизмы. По другой модификации вырезают большой блок среды культурой испытуемого антагониста и ставят его в центр чашки Пет)

на тонкий слой агара. Тест-микробы подсевают штрихами по радиусам к блоку испытуемой культуры (рис. 79). Чашки инкубируют в термостате в течение 3—7 сут при 28—30°. Максимальное действие антибиотика проявляется на том организме, развитие которого начинается на большем расстоянии от блока.

Методы исследования микроорганизмов в ризосфере. Метод Красильникова. Лопатой подкапывают почву под растением (используют

от 1 до 100 экземпляров и более), извлекают корни, стряхивают с них непрочно удерживаю- щуюся почву и оставляют прочно связанную с корнями. Затем корни срезают в стерильный пергаментный пакет. Навеску корней с почвой (5—10 г) помещают в колбу со 100 мл стерильной воды. Посев производят обычным способом. После посева корни вынимают из колбочки, слегка подсушивают между листами фильтровальной бумаги и взвешивают. По разности в весе корней с почвой и отмытых корней узнают вес ризосферной почвы, взятой для анализа. В качестве питательной среды для посева используют МПА, среду Эшби, крахмало-аммиачный агар, сусло-агар и другие питательные среды. Контролем служат посевы почвенных суспензий, из внекорневой зоны.

Вследствие того, что количество микроорганизмов в ризосферной почве всегда больше, чем в контрольной, для посевов из почвы ризосферы почвенные суспензии разводят в большее число раз, чем из контрольной почвы. Рассчитывают ризосферный эффект, который выражают как соотношение числа клеток микроорганизмов в 1 г ризосферной и контрольной почве на каждой среде.

Метод последовательных отмываний корней по Теппер. Из почвенных монолитов с растениями стерильным пинцетом и ножницами отбирают 1 г молодых корней (примерно одного диаметра) с приставшими к ним частицами почвы. Корни помещают в колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды и взбалтывают в течение 2 мин. Стерильным крючком или пинцетом корни извлекают из колбы и переносят последовательно во вторую, третью, четвертую, пятую, шестую и седьмую колбы, также содержащие по 100 мл стерильной водопровод

ной воды. В каждой колбе корни отмывают по 2 мин. Желательно, чтобы в последней (седьмой) колбе в воду перед стерилизацией было добавлено 5—7 г песка. Из каждой колбы отдельно стерильной пипеткой берут по капле отмывной воды и высевают на поверхность питательной среды на чашки Петри.

Для сравнительного определения количества микроорганизмов в ризосфере и ризоплане по методу Теппер суспензию из первого отмывания дополнительно взбалтывают 5 мин, затем из нее готовят разведения, из которых делают посевы. Содержимое остальных шести колб сливают вместе и приготавливают последовательные разведения, из которых делают посевы. Количество ризосферной почвы, попавшей с корнями в первую колбу, находят по разности первоначальной навески и навески отмытых корней. Для этого из последней порции отмывной воды корни извлекают, помещают на фильтровальную бумагу для удаления воды и взвешивают. При определении количества микроорганизмов на 1 г корней среднее число колоний, выросших на чашках, умножают на количество капель в 1 мл, на степень разведения и на 600 (6 смывов по 100 мл в каждом) и делят на массу сырых корней.

Пространство вблизи корня условно разделяют на три зоны. Наиболее удаленную от корней почву считают зоной эдафосферы. Почву эдафосферы собирают после легкого встряхивания корней. Собственно ризосферную почву получают путем отделения стерильным скальпелем прикорневого слоя почвы не более 0,3 см. Оставшиеся на очищенных от почвы корнях микроорганизмы считают представителями ризо- планы. Обработку почвы и корней проводят на низкочастотном дезинтеграторе типа УЗДН-1 (22 кГц, 0,4 А).

Методы изучения образования клубеньков на корнях бобовых и небобовых растений. Процесс инокуляции растений культурами бактерий и актиномицетов для образования клубеньков на корнях бобовых (клевер, горох, соя) и небобовых (ольха, облепиха) растений проводят по методу Фереуса. Два предметных стекла толщиной 0,7—0,8 мм с проложенной между ними с одного конца стеклянной пластинкой располагают так, чтобы край одного стекла выступал над краем другого примерно на 3—5 мм, и прочно связывают нитками. Стеклянные пластинки для прокладки готовят из покровных стекол. Систему стекол стерилизуют в автоклаве в чашках Петри. Заполняют простран

ство между предметными стеклами стерильной расплавленной агари- зованной минеральной средой следующего состава (г/л): СаС12— 0,1; MgS04*7H20 — 0,12; КН2Р04 — 0,1; Na2HP04 — 0,15; лимоннокислое ре — 0,005; следы Мп, Си, В, Мо, агар-агар — 6; pH 6,6 (доводят серной кислотой). В полужидкий агар между стеклами помещают 3—4 проростка растений и системы опускают в стаканчики с ватными пробками, на дне которых налита жидкая минеральная среда того же состава (рис. 80). Через сутки проростки инокулируют суспензией 2— 3-суточных культур бактерий или актиномице- тов. Для микроскопирования препарата бритвой срезают нитки, удаляют одно стекло, на агар наносят каплю воды и на нее помещают покровное стекло. Наблюдают за образованием клубеньков на корнях инокулированных растений.

Определение токсического действия почвенных микроорганизмов на растения. Почвенные микроорганизмы способны образовывать вещества различной химической природы, подавляющие рост растений, — токсины. Накопление в почве токсинов обусловливает токсические свойства почв, определяемые следующим методом. Испытуемую почву с помощью пинцета освобождают от крупных корневых остатков и тщательно перемешивают металлическим шпателем. Берут навеску 60 г и помещают в чашку Петри (опыт проводят не стерильно).

Степень токсичности почвы определяют по разнице в количестве проросших семян и длине проростков и корней в опыте и контроле. Токсичными считают почвы, вызывающие угнетение прорастания семян на ^20—30% и более. Определение токсичности почвы рекомендуется проводить на свежих образцах почвы, так как после хранения образцов токсичность их значительно меняется.

Использование азотобактера как тест-организма для определения токсических свойств почвы. Агаризованную среду Эшби разливают в стерильные чашки Петри и после застывания среды покрывают ее сте

рильными пластинками целлофана, который тщательно расправляют на поверхности агара металлическим шпателем. Целлофан предварительно нарезают кружками по размеру чашки Петри и во влажном состоянии стерилизуют в автоклаве. На поверхность целлофана в центр чашки Петри помещают испытуемую почву на площади диаметром 2 см. Почву предварительно увлажняют до пастообразного состояния. На дне чашки карандашом по стеклу отмечают границы почвенной лепешки. Чашки инкубируют в термостате при 28° в течение суток. Через сутки целлофан вместе с почвой снимают с агара, а среду засевают суточной культурой Azotobacter chroococcum. В случае наличия токсических веществ в почве азотобактер не вырастает на пластинке агара в том месте, где находилась почва, здесь на газоне образуется стерильная зона. В качестве тест-микроорганизмов могут быть использованы и другие культуры, в таком случае выбирают соответствующие питательные среды для их развития.

Определение токсических свойств чистых культур микроорганизмов. Для определения токсичности выделенных из почвы культур микроорганизмов их предварительно выращивают в жидких питательных средах в покое пли на качалке. Определение токсичности культуральной жидкости производят у бактерий на 2-й день, у актиномицетов на 5—10-й день, у грибов — на 7—10-й день роста. В качестве тестов для определения токсинов используют семена различных растений. Токсичность микроорганизмов определяют методом замочки семян.

Отфильтрованную культуральную жидкость разливают в стаканчики, фарфоровые чашечки или бюксы на 100 мл, отбирают по 20— 50 семян растений, замачивают их в каждом сосуде 20—24 ч. Для контроля семена замачивают на тот же срок в водопроводной воде и стерильной питательной среде. Те и другие семена раскладывают на увлажненной вате с фильтровальной бумагой в чашках Петри. Все чашки увлажняют равным количеством водопроводной воды. Токсичными считают культуры микроорганизмов, вызывающие либо снижение всхожести семян, либо угнетение развития проростков и корней более чем на 30% по сравнению с контролем.

Определение стимулирующего действия темноокрашенных пигментов грибов и актиномицетов на растения. Почвенные грибы семейства Dematiaceae и многочисленные почвенные актиномицеты выделяют темноокрашенные пигменты — меланины, напоминающие по своим свойствам гуминовые кислоты и участвующие в образовании гумусовых веществ в почве. Как и гуминовые кислоты, микробные меланины обладают стимулирующим действием на растения. Определяют стимулирующее действие микробных меланинов методом замочки семян. Семена растений замачивают в культуральной жидкости микроорганизмов или в растворе темноокрашенных пигментов в 0,1 н. NaOH. Контролем служат семена растений, замоченные в воде или в растворе 0,1 н. NaOH. Опыт ставят таким же образом, как и в случае замачивания семян в культуральной жидкости токсинообразующих микроорганизмов. Стимулирующее действие микробных меланинов на растение определяют по увеличению всхожести семян, по усилению развития проростков и корней более чем на 30% по сравнению с контролем.

Применение сканирующего электронного микроскопа для наблюдения за взаимодействием микроорганизмов и растений. Эпифитные микроорганизмы, развивающиеся на поверхности стеблей, листьев и семян растений (микроорганизмы филлосферы) и микроорганизмы, развивающиеся на корнях растений (микроорганизмы ризопланы), можно наблюдать с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ). На препаратах (приготовление препаратов см. ниже), приготовленных из семян, листьев и корней растений, можно проследить за развитием микроколоний бактерий, дрожжей, грибов, выявить особенности прикрепления микробов к поверхности растительных тканей (см. рис. 75).

Наблюдения за взаимоотношениями в культурах простейших с бактериями. Почвенные простейшие питаются избирательно различными бактериями. Для демонстрации этого явления выделяют чистые культуры наиболее распространенных и характерных почвенных простейших; из жгутиконосцев, например, Bodo\ из амеб — Vohldkampfia Umax, Hartmanella rhyzodes\ из инфузорий — Colpoda. Для получения чистых культур простейших их культивируют на Azotobacter chroococ- cum на среде Федорова с микроэлементами следующего состава (г/л); сахароза — 20,0, К2НРО4 — 0,3, СаНР04 — 0,2, K2S04 — 0,2, MgS04 — 0,3, NaCl — 0,5, FeCl3'—0,01—0,1, CaC03— 5; смесь микроэлементов 1 мл. Смесь микроэлементов (г/л дистиллированной воды): Н3В03 — (NH4)2Mo04 — 5,0, KJ — 0,5, NaBr — 0,5, ZnS04 —0,2, A12(S04)3- 0,3. Бактерии выделяют и культивируют на элективных средах. Оли- гонитрофилы — на средах Федорова, Эшби; нитрифицирующие бактерии — на среде Виноградского, денитрифицирующие — на видоизмененной среде Гильтая; аэробные целлюлозоразлагающие бактерии —* на среде Гетчинсона; аммонифицирующие бактерии — на мясо-пеп- тонном агаре (МПА) с суслом или на МПА. Перед опытом в каждом варианте определяют плотность популяции данного вида простейших и бактерий. Для определения интенсивности развития протистов на различных бактериях в каждую пробирку с развивающимися бактериями вносят по 2 мл культуры простейших. Для сравнения полученных результатов интенсивность развития протистов выражают в процентах, принимая за 100% рост на олигонитрофильной группе микроорганизмов.

Азотобактер — хороший пищевой источник для протистов. Взаимоотношения между азотобактером и почвенными простейшими сложны и включают не только истребление одного организма другим, но и элементы симбиоза. Эксперименты по влиянию простейших на фиксацию азота и интенсивность развития азотобактера проводят в смешанных культурах бактерий и простейших. Чистые культуры простейших (на одном виде бактерий) выращивают путем повторных пересевов их на культуру азотобактера в элективной среде Федорова, что позволяет освободиться от посторонних бактерий.

Опыт проводят в течение 7—10 дней при 26°. Плотность популяции азотобактера определяют методом разведений, подсчет простейших в жидких средах проводят микроскопически.

Для изучения влияния простейших на клубеньковые бактерии проводят эксперименты с различными штаммами клубеньковых бактерий и разными видами амеб. Бактерии культивируют на агаризованных средах для клубеньковых, амебы — на чистых культурах изучаемых бактерий. Для установления интенсивности размножения и продвижения амеб по колонии бактерии высевают штрихом из культуры одной плотности на агаризованную среду в чашки Петри. Когда колонии бактерий образуют явно выраженный штрих, в начале штриха наносят в виде точки амебы. Исходные предпосевные плотности бактерий и простейших учитывают по вариантам. Опыт проводят в течение 10 сут при 26°. Об интенсивности развития амеб судят по быстроте их продвижения по штриху. Наибольшую интенсивность проявляют Amoeba albida. Определяют развивающееся количество клеток микроорганизмов: с противоположного исходному конца штриха делают посев их в жидкую среду. Подсчитывают количество выросших простейших и бактерий.

Опыты, демонстрирующие возможность роста и развития Amoeba albida при питании Cytophaga lutea, проводят на твердой и жидкой среде Гетчинсона. В опытах на твердой среде Гетчинсона после застывания агара в чашке Петри на его поверхность накладывают кружок взвешенной стерильной фильтровальной бумаги. Затем производят посев на одну серию чашек определенного количества целлюлозоразлагающих бактерий, а на другую серию чашек — бактерий с простейшими. Чашки, засеянные одними бактериями, служат контролем. Опыт ставится в трех повторностях. Чашки инкубируют в термостате при 28—30° в течение 30 сут. Фильтровальная бумага разлагается бактериями. Оставшуюся часть фильтровальной бумаги высушивают в сушильном шкафу до постоянного веса и взвешивают на аналитических весах. По весовой разнице высчитывают количество разрушенной целлюлозы чистыми культурами бактерий и в совместных опытах с простейшими. Cytophaga lutea с амебами разрушают приблизительно на 20% больше бумаги, чем одни бактерии.

Наблюдения за питанием простейших дрожжами. Для выяснения использования амебами дрожжей в качестве источника пищи пользуются двумя методами.

Первый метод. На чашки Петри с голодным агаром наносят штрихи дрожжей длиной 2 см. Предварительно готовят густую суспензию дрожжей и петлей по трафарету, подкладываемому под чашку, наносят штрихи с двойной повторностью. В конец каждого штриха инокулируют цисты и вегетативные клетки амеб. Наблюдение проводят на 3—4 сут. Отмечают наличие в препаратах амеб с клетками дрожжей (см. рис. 81), степень выедания штриха дрожжевых клеток амебами, инцистирование амеб. Полное выедание штриха дрожжей Cryptococcus albidus отмечается, например, клетками амеб Hartmanella rhyzodes, Vohldkampfia Umax. На некоторых видах дрожжей амебы инцистируются, до того как выедают штрих полностью.

Второй метод. В большие пробирки наливают по 1 мл физиологического раствора и стерилизуют. В пробирки вносят смешанные культуры различных дрожжей и амеб. Стерильной пипеткой каплю смеси помещают в камеру Горяева и просчитывают отдельно амебы и дрожжи. Затем пробирки помешают в термостат на 24° и делают просчеты через каждые 12 ч. Учитывают изменение числа вегетативных

Рис. 81. Почвенные амебы, питающиеся клетками дрожжей

клеток и цист амеб и дрожжей в совместной культуре, изменение морфологии дрожжевых клеток.

Взаимоотношения водорослей и почвенных беспозвоночных животных. При выращивании водорослей на мембранных фильтрах, помещенных на почву, отмечают появление простейших, в частности амеб, клешей, энхитреид. Уменьшение количества водорослей на фильтрах или полное их исчезновение в результате выедания заметно макроскопически.

Опыт по выявлению выедания почвенных водорослей энхитреида- ми проводят следующим образом. В чашки Петри помещают по 5 г почвы, увлажненной до пастообразного состояния. Через два дня чашки с почвой стерилизуют при 1,5 атм 45 мин. На приготовленные таким образом почвенные пластинки помешают мембранные фильтры (с диаметром пор менее 1 мкм), на которые наносят по 1 мл суспензии водорослей (представителей родов Chlorella или Chlamydomonas) с ранее установленным титром. В опытные чашки чс фильтрами помешают по три особи энхитреид, в контрольные — водоросли или энхитреиды отдельно. Чашки инкубируют при освещении 1300 лк. Через 2—3 нед учитывают количество водорослей на фильтрах. Массу водорослей снимают с поверхности фильтра, разбивают с помощью гомогенизатора и подсчитывают в камере Горяева. Чтобы иметь представление не только о численности съеденных водорослей, но и об их биомассе, определенный объем суспензии водорослей с установленным титром фильтруют через заранее взвешенные бумажные фильтры. Фильтры высушивают при 105° и определяют абсолютно сухой вес водорослей. Затем подсчитывают вес одной клетки водорослей и проводят пересчет численности съеденных клеток на биомассу. Количество энхитреид в почве учитывают путем тщательного просматривания под микроскопом МБС-1.

Методы исследования взаимодействия дождевых червей с микроорганизмами. Взаимодействие почвенных беспозвоночных с микроорганизмами исследуют обычно в системах: почва — экскременты; кишечник животных — экскременты; почва — кишечник — экскременты. Исследуют присутствие микроорганизмов в отдельных компонентах перечисленных систем.

Существует метод исследования количественного и качественного состава микрофлоры кишечника и экскрементов дождевого червя Lurrt- bricus rubellus. Содержание кишечника и экскременты высевают (в виде суспензии в воде) на соответствующие питательные среды, предназначенные для учета основных систематических и физиологических групп микроорганизмов.

Жизнедеятельность дождевых червей способствует развитию аммонифицирующих, нитрифицирующих микроорганизмов, анаэробных азотфиксаторов, активизируются целлюлозоразрушающие микроорганизмы.

Исследования экскрементов Lumbricus rubellus выявляет, как правило, в 3 раза больше бактерий, растущих на МПА, в 4 раза больше бактерий, растущих на крахмало-аммиачном агаре, в 6 раз больше актиномицетов, в 2—15 раз больше грибов по сравнению с почвой.

Методы исследования взаимоотношений энхитреид с микроорганизмами. Обычно исследуют кишечник животных и почву, в которой обитают энхитреиды. Производят высев содержимого кишечника на плотные питательные среды. Для этого 1 г содержимого кишечника растирают в ступке, помещают в пробирку с 10 мл стерильной водопроводной воды, размешивают стерильной стеклянной палочкой до получения гомогенной суспензии и производят посев. Для сбора экскрементов животных выдерживают в экспериментальных сосудах 6 дней, после чего приготавливают суспензии экскрементов и делают посев.

Для изучения процессов разложения растительных остатков и сукцессии микроорганизмов в экскрементах энхитреид анализируют экскременты в течение месяца с первого дня после их выброса. В кишечнике и экскрементах энхитреид особенно усиливается процесс аммонификации, о чем свидетельствует увеличение численности аммонифицирующих микроорганизмов.

Методы исследования взаимоотношений диплопод с микроорганизмами. Связи диплопод с микроорганизмами выявляют методом содержания животных на опаде растений и сравнительного исследования микроорганизмов в опаде, кишечнике животных и их экскрементах. Производят посевы на плотные питательные среды из суспензии содержимого кишечника, экскрементов и почвы, как описано ранее.

В кишечнике диплопод осуществляются начальные стадии минерализации органических соединений азота. Процессы разложения органического вещества углубляются в экскрементах, происходит дальнейшая минерализация органического вещества, увеличивается активность микроорганизмов, живущих за счет органического и минерального азота. В кишечнике, и особенно в экскрементах диплопод, усиливается по сравнению с подстилкой процесс разложения клетчатки мик- собактериями.

Методы исследования взаимоотношений почвенных беспозвоночных с макро- и микромицетами. Для выяснения взаимоотношений между коллемболами, энхитреидами, дождевыми червями, с одной стороны, и грибами — с другой, в чашки Петри с сусло-агаром и культурой гриба «подсаживают» животных. Затем прослеживают поведение животных на культуре грибов. Отмечают притягательность мицелия, его пое- даемость, подвижность животных, возможность завершения цикла и рост (линьки), смертность животных. Отношения почвенных беспозвоночных и грибов могут быть различными. Антагонистические — мицелий, выделяя вредные продукты обмена веществ, губительно воздействует на животных. В отдельных случаях ядовит мицелий самих грибов и беспозвоночные погибают в результате кратковременного питания мицелием или простого соприкосновения с мицелием. Мицелий пригоден для периодического питания беспозвоночных и может служить в качестве части их пищи. Мицелий обеспечивает развитие животных и может служить единственным источником питания длительное время.

В случае антагонизма подсаженные на мицелий гриба животные спешно его покидают, а при наиболее сильном воздействии — остаются парализованными. Живые экземпляры концентрируются в самом дальнем от гриба месте чашки или пытаются скрыться в агаре, проедая в нем ходы и «колодцы». Такая реакция наблюдается у коллем- бол и энхитреид при соприкосновении с грибами — моховиком желтобурым, лисичкой настоящей, чесночником, некоторыми микромицетами (Alternaria tenuis, Penicillium cyclopium). Дождевые черви парализуются при высаживании их на чашку с пятнами мицелия масленка лиственничного.

Для демонстрации второго типа взаимоотношений на мицелий мухомора красного, березовика, свинушек толстой и тонкой, белого гриба и козляка подсаживают личинки Collembolla. Беспозвоночные в этих условиях существуют 10—15 дней и питаются довольно интенсивно мицелием. У беспозвоночных все это время, кроме последних дней, сохраняется подвижность. Дождевые черви в течение длительного времени способны переносить присутствие мухомора красного и Fusarium oxysporum, но не питаются ими.

Для демонстрации третьего типа взаимоотношений беспозвоночных и грибов на мицелий лаковицы розовой, строфании Горнемана, строчка обыкновенного, дождевика шиповатого подсаживают коллем- бол. Беспозвоночные чувствуют себя хорошо в течение длительного времени, практически они могут жить на диете этих грибов, линять, размножаться.

Дождевые черви и энхитреиды, как правило, не употребляют в пищу высших грибов. Коллемболы и личинки двукрылых активно питаются мицелием многих грибов.

Для исследования возможности распространения мицелия и спор грибов с экскрементами животных последних стерилизуют стрептомицином с поверхности и пересаживают в чашки Петри со стерильным сусло-агаром. Затем прослеживают рост грибов на питательной среде. Споры Penicillium cyclopium и Fusarium oxysporum, попадая в кишечник вместе с гифами в процессе питания, активно переносятся животными через экскременты. Споры Alternaria tenuis перевариваются в кишечнике коллембол и личинок Sciaridae. Опыты по пересадке животных с отмытой, но не простерилизованной поверхностью тела показали, что мицелий грибов активно распространяется животными.