Микроскопические грибы

Из различных стадий распада еловой древесины была выделена довольно богатая флора микроскопических грибов. При определении культур мы пользовались в основном сводкой Рабенхорста (26), для определения видов рода Penicillium — монографией Тома (32), а также Биурж (2) и др.

Для тех из выделенных нами видов, которые описаны в литературе недостаточно подробно, приводим описание как характера роста культур на разных средах, так и морфологии самого организма.

Сем. Mucoraceae

Представители семейства мукоровых были нами выделены из еловых колод, находящихся в последней стадии распада (красная гниль). Всего были выделены 3 вида: Mucor Ramannianus Moller, Tieghemella tieghemii Naumov и Mucor silvaticus Hagem.

Все перечисленные виды были выделены при посеве на сусло-агар.

Mucor Ramannianus Moller. Этот вид на сусле развивается в форме круглых розовых бархатистых колоний, хорошо очерченных; на федах из древесины роста не наблюдалось, на средах из бурой и красной гнили — слабый рост в виде поверхностного пушка, образование плодоношений задерживается. На средах с фильтровальной бумагой, в особенности при добавлении пептона, наблюдается в первых генерациях рост в форме небольших розовых пушистых колоний, однако, дальнейшие пересевы удаются очень плохо. Применение целлюлозных сред может быть полезно при выделении культур, так как М. Ramannianus в отличие от других видов Mucor растет на сусле довольно медленно и при обилии в посевном материале других видов плесеней может быть ими заглушено.

Mucor silvaticus Hagem. Этот вид пышно развивается на сусле, часто заглушая на чашках рост других видов в первичных посевах.

Высокий белый ватообразный мицелий в дальнейшем приобретает буроватый оттенок. Хорошо видны простым глазом черные головки спорангиев. На среде Чапека с сахарозой в качестве источника углерода рост скудный: обычно появляется слабый поверхностный мицелий, быстро погибающий.

Tieghemella tieghemii Naumov. Этот вид подобно Mucor silvaticus растет пышно на сусле. Мицелий приобретает при спороноше- нии синеватый оттенок; на остальных средах характер тот же, что и М. silvaticus.

Сем. Chaetomiaceae

Chaetomium affineae Corda выделен из древесины ели в фазе развития Fomes pinicola Cke. На средах с сусло-агаром этот вид образует пушистый мицелий, постепенно принимающий яркожелтую окраску; в массе мицелия можно простым глазом обнаружить перитеции гриба в форме чёрных точек.

На сусле этот вид развивается довольно медленно и поэтому легко подавляется другими быстро растущими формами. На средах из красной гнили и лигнине рост не был обнаружен. На фильтровальной бумаге С. affineae растет в форме беловатого, быстро желтеющего мицелия с хорошо заметными перитециями. Характеристика роста на разных средах позволяет выделить как наиболее пригодные для его культуры среды из древесины и фильтровальной бумаги.

Сем. Polyporaceae

Fomes pinicola Cke. Культура этого основного разрушителя еловой древесины может быть легко получена как из карпофоров гриба, расположенных на колоде, так и из участков пораженной грибом древесины.

При посеве кусков древесины или эмульсии древесной трухи на ‘сусло-агар обычно наблюдается энергичный рост в форме снежнобелого лучистого мицелия вокруг посеянных кусочков. Если посев сделан из участков колод, находящихся в некотором отдалении от плодового тела, то по большей части кроме мицелия F. pinicola развиваются и различные виды плесеней, главным образом Penicillium.

На средах из древесины и бурой гнили мицелий F. pinicola развивается не так энергично, как на сусле. Сперва на посеянных кусочках появляется редкий пушок, который затем переходит на питательную среду в форме диффузного мицелия. Под микроскопом в участках питательной среды, отдаленных от засеянных кусочков, можно заметить отдельные гифы с хорошо выраженными пряжками.

Сем. Hyphales

Acremonium verticillatum Link. Этот вид выделен из еловой древесины, находящейся в стадии красной гнили. На сусло-агаре колонии сперва беловатые, пушистые, с нижней стороны розовые, затем на поверхности мицелия выступают капли жидкости и культура приобретает шерстистый лохматый вид.

На средах из древесины роста нет. На средах из белой и красной гнили рост в виде буроватого налета. Наилучшая среда для выделения этого вида — гелевые пластинки с фильтровальной бумагой и пептоном. На этой среде гриб развивается в виде буроватых пушистых поверхностных колоний. Хотя рост на этой среде довольно медленный, но отсутствие конкурирующих видов делает возможным выделить A. verticillatum из такого богатого разнообразными формами микроорганизмов субстрата, как красная гниль.

Род Н а р 1 о g г а р h i u m

Из древесины ели, находящейся в переходной стадии и стадии красной гнили, было выделено несколько видов Haplographium.

Имеющиеся в литературе описания этого рода сделаны на основании гербарных материалов без учета характера роста грибов на различных питательных средах, что весьма затрудняет точную идентификацию ряда видов. Поэтому мы приводим описание общего характера развития

выделенных нами культур на различных средах и детальное описание морфологии каждого вида.

Характерная особенность этих грибов — хорошее их развитие на средах с фильтровальной бумагой в качестве источника углерода.

Hapl*ographium atrofuscum Pneuss. На сусло-агаре колонии серые, бархатистые, резко очерченные, с нижней стороны зеленовато-оливковые. Рост на сусле замедленный, вследствие чего при посеве исходного материала на этом субстрате Haplographium подавляется другими плесневыми грибами. На среде Чапека характер колоний тот же, но рост еще медленнее. На средах из древесины и белой гнили вырастает поверхностный диффузный мицелий в виде сероватого налета.

Микроскопия. Конидиеносцы прямостоящие, септированные, диаметром 3-4 микрона, длиной 120 микронов, в нижней части окрашенные в темнокоричневый цвет, кверху почти бесцветные. Вегетативный мицелий также бесцветный (окрашены только участки гиф, от которых отчленяются конидиеносцы). Вершина конидиеносца делится на две дивергирующих ветви, из которых одна укорочена; вершина каждой ветви делится вновь, образуя ветви второго и третьего порядка. На концах тонких прозрачных веточек находятся стеригмы с цепочками круглых спор. Споры большей частью склеены, и весь конидиеносец имеет вид плотного пучка. Цепочки конидий легко распадаются, поэтому для определения характера прикрепления конидий культуры нужно исследовать очень внимательно. Конидии — круглые, дымчатые, диаметром олоко 3 микронов, с каплей масла внутри.

Haplographium bicolor Grove. Характер роста этого гриба на различных питательных средах в общих чертах тот же, что и у предыдущего вида. Несколько отличен рост на фильтровальной бумаге: на этой среде Н. bicolor образует характерные бархатистые дерновинки сперва голубовато-серые, затем темнеющие, причем бумага в местах развития мицелия бывает окрашена в розовый цвет, при изменении же реакции среды из кислой в щелочную розовый пигмент переходит в светложелтый. Рост на средах с фильтровальной бумагой и целлюлозой очень хороший. На сусло-агаре пигмент выделяется только в том случае, если Н. bicolor развивается в смеси с каким-либо другим видом; тогда на месте соприкосновения колоний появляется розовое окрашивание.

Микроскопия. Конидиеносцы прямостоящие, длиной до 300 микронов, септированные, снизу расширенные и окрашенные в темнокоричневый цвет, в верхней части бесцветные, с длинными ветвями.

Haplographium delicatum Berk. Характер культур на различных питательных средах и способность выделять пигмент полностью совпадает с Н. bicolor, от которого Н. delicatum отличается морфологически.

Конидиеносцы прямостоящие, величиной не больше 120 микронов, септированные, снизу окрашенные в темнокоричневый цвет, а свер-

Табл и ца 1

ху бесцветные ветвящиеся. Конидии бесцветные, овальные или яйце*’ видные, длиной 2-3 микрона и шириной 1-2 микрона. Цепочки конидий подобно предыдущим видам легко распадаются. Конйдии склееныgt; слизью и образуют головки на концах конидиеносцев.

Род Penicillium

В разлагающейся древесине род Penicillium представлен чрезвычайно богато. В наибольших количествах Penicillium встречается в свежевыпавших колодах и в стадии развития основных дереворазрушающих грибов в качестве спутников Fomes pinicola Cke. и Lenzites sepiaria Fr. В стадии красной гнили количество видов Penicillium заметно уменьшается. Большинство видов этого рода хорошо развивается на сусле и на среде Чапека. На средах из лигнина и древесины — как здоровой, так и находящейся в разных фазах распада (бурая и красная гниль) — Penicillium растет значительно хуже; большей частью наблюдается поверхностный диффузный рост мицелия с редкими рассеянными конидиеносцами. На средах с клетчаткой большинство видов не развивалось, исключение представляют Р. brevicaule Sacc., Р. rugulosum Thom, и Р. Namylovoskii Zal.

Общая характеристика роста различных видов Penicillium и ближайших к нему родов Paecilomyces и Glioclaudium приведена в табл. 1.

Род Sporotrichum

В последних стадиях разложения еловой древесины (красная гниль) постоянно встречаются различные виды Sporotrichum. Представители этого рода отличаются медленным ростом на сусле и легко подавляются плесневыми формами.

Выделение из древесины хорошо удавалось нам только при посевах на элективные среды. Наиболее благоприятны среды с целлюлозой или фильтровальной бумагой, причем ряд видов развивается преимущественно в кислых растворах, некоторые же, наоборот, предпочитают щелочную реакцию среды или нейтральные растворы, содержащие пептоны.

Sporotrichum flavissimum Link. На сусле рост сперва в виде матовых гладких колоний, покрывающихся затем высоким желтым ватообразным мицелием. На фильтровальной бумаге в кислом растворе развиваются поверхностные колонии с светложелтым пушистым мицелием. На средах из древесины и различных стадий гнили слабый рост в виде небольшого пушка.

Sporotrichum laxum Nees. На сусле развиваются плотные беловатые, меловидные, порошащие колонии. Рост на средах с фильтровальной бумагой в щелочном растворе (pH — 7,2) лучше, чем в кислом. На бумаге образуются крупичатые меловидные колонии, окрашивающие бумагу в желтый цвет. На средах из древесины и бурой гнили роста нет, на красной гнили и лигнине появляются чрезвычайно мелкие точечные меловидные колонии.

Sporotrichum roseum Link. На сусле развиваются сперва матовые, снизу светложелтые колонии, покрывающиеся затем розовым пушистым мехообразным мицелием с шнуровидными запутанными пучками гиф. На средах из фильтровальной бумаги развивается розоватый поверхностный мицелий; последующие пересевы на фильтровальную бумагу большей частью удаются плохо. На средах из лигнина и древесины в различных стадиях разложения почти не развивается.

Род Tnichosporium

Ttfichosporium splenicum Sacc. et Berl'. По характеру роста и виду колонии этот род близок к предыдущему и отличается лишь бурой окраской спор. Tr. splenicum выделен из красной гнили. На среде с суслом образуются сперва беловатые с поверхнрсти, меловидные, снизу зеленоватые колонии, затем с центра колонии начинает развиваться пушистый мехообразный мицелий с шнуровидно-перепле- тенными пучками гиф. На средах с фильтровальной бумагой и целлюлозой с добавкой пептона развиваются пушистые поверхностные дерно- винки мышино-серого цвета; последующие пересевы на фильтровальную бумагу удаются плохо. На средах из древесины и лигнина очень скудный рост. Для выделения видов Sporotrichum и Trichosporium лучше применять среды с фильтровальной бумагой, для сохранения же культур — сусло- агар.

Род Trichoderma

Виды рода Trichoderma появляются в древесине только после того, как она подверглась воздействию основных дереворазрушающих грибов. Trichoderma выделялась многочисленными исследователями из почвы, лесной подстилки и других растительных материалов и рассматривается как один из активных почвенных микроорганизмов, принимающих участие в разложении растительных остатков.

Trichoderma Koningi Oudem. выделен из еловой древесины в переходной стадии и в стадии красной гнили. На сусло-агаре развивается белый мицелий с многочисленными комочками спор, постепенно зеленеющими; в дальнейшем вся культура приобретает бархатистый вид и окрашена в сине-зеленый цвет. На средах из здоровой древесины гриб развивается очень слабо, в форме паутинистого поверхностного налета с рассеянными, быстро зеленеющими комочками спор. На средах из белой и красной гнили рост значительно лучше: на поверхности среды развивается редкий мицелий с большим количеством быстро зеленеющих спор. На средах с фильтровальной бумагой мицелий гриба развивается довольно быстро, сперва появляется пушок белого мицелия, а затем поверхность бумаги делается зелёной благодаря развитию спор. На кислых растворах рост лучше, чем на щелочных. Тг. lignorum Tode выделена из еловой древесины в стадии красной гнили. Характер роста на питательных средах почти не отличается от Tr. Koningi Oudem.

Mycelium sterilis

Помимо описанных выше грибов нами был выделен ряд стерильных мицелиев без плодоношений. Среди этих мицелиев имеются и культуры базидиомицетов, точное определение видов которых может быть сделано только путем сопоставления чистых культур мицелиев, выделенных из древесины, с культурами, полученными непосредственно из плодовых тел грибов, развивающихся на колодах.

На этом можно закончить описание важнейших микроскопических грибов, выделенных нами из еловых колод в разных стадиях разложе

ния. В списке не упомянуты виды, встречающиеся сравнительно редко, например, Cephalosporium, Aspergillus, Cilindrosporium и др.

Из описания выделенных форм микроорганизмов можно видеть, что по своим физиологическим свойствам обнаруженные нами виды различаются друг от друга очень резко. Если для выделения чистых культур применять только обычные стандартные среды, как сусло и сливовый отвар, то целый ряд форм вообще нельзя было бы выделить, так как на этих средах быстро растущие плесени большей частью заглушают -специфическую флору грибов, связанную с разложением отдельных компонентов древесины.

Одна из важнейших задач данной работы, помимо выявления видового состава микрофлоры еловых колод, — разработка такой методики, которая позволила бы провести массовые исследования колод в различных ценозах с уверенностью, что важнейшие формы микроорганизмов будут выделены.

По характеру роста на различных питательных средах можно выделить три важнейших группы микроскопических грибов.

В первую группу входят формы, энергично развивающиеся на средах с суслом, богатых легко доступными питательными веществами. Сюда относятся большинство видов Penicillium и Mucor. Грибы этой группы развиваются на сусле столь энергично, что подавляют рост других, более специфических форм.

Во вторую группу входят виды, которые выделяются преимущественно на средах элективных (в данном случае среды с клетчаткой и древесиной в разных фазах распада). Сюда относятся Haplographium, Sporotrichum, Trichosporium.

Наконец, в третью группу можно объединить формы, которые выделяются как при посеве на сусло, так и на элективные среды с древесиной и. клетчаткой. Таковы виды Trichoderma, Fomes pinicola Скц и другие базидиомицеты. При испытании сред мы испробовали несколько вариантов, меняя источник углерода, азота, концентрацию водородных ионов и пр. В результате исследования ряд сред был отброшен. Так, например, применяя культуры на лигнине, мы стремились выделить формы, развивающиеся за счет наиболее стойких элементов древесины. Однако таким способом нам не удалось обнаружить какие-либо специфические формы, которые не росли бы на средах с древесиной. Поэтому мы пришли к заключению о возможности ограничиться только средами из древесины, находящейся в различных фазах распада. Добавление к этим средам питательных солей не вносит существенных изменений в количество выделяемых видов.

При испытании сред с клетчаткой в качестве источника углерода оказалось, что целлюлоза из еловой древесины и фильтровальная бумага вполне равноценны. Однако, очень большое значение при этом имеет применение различных источников азота и реакция среды. Наиболее удобен метод гелевых пластинок с фильтровальной бумагой.

Достаточно большой материал по испытанию сред позволил заключить, что, применяя сусло-агар, гелевые пластинки с фильтровальной бумагой (в двух вариантах — с сернокислым аммонием и пептоном) и среду из древесины, соответствующую фазе распада, можно рассчитывать выделить все важнейшие формы микроскопических грибов.

При посеве материала мы применяли два способа посева: эмульсией и кусочками древесины. Оба метода имеют свои преимущества и недостатки.

Посев кусочками позволяет судить о доминирующих в исследуемом материале мицелиях по количеству кусков, обрастающих тем или иным видом, и облегчает выделение вегетативных форм грибницы. Однако таким путем выделяются не все виды, находящиеся в древесине. При посеве кусочками хорошо развивается Penicillium, Mucor, Tricho- derma и некоторые базиодиомицеты, различные же виды Sporotrichum и Haplographium выделяются с трудом. При качественном исследовании микрофлоры древесины засев эмульсией дает более надежные результаты. Поэтому мы и применяли его при дальнейших массовых экологических обследованиях, используя метод посева кусками только в тех случаях, когда было трудно получить эмульсию в стерильных условиях (например, из твердой древесины), или в качестве дополнительного при более детальных обследованиях.

Рост грибов на описанных средах можно характеризовать следующим образом. На сусле развиваются хорошо выраженные колонии плесеней Penicillium, Mucor, Trichoderma, а также некоторые базидио- мицеты. Fomes pinicola Ске., например, пышно развивается на сусле и подавляет флору плесеней, если посевной материал взят вблизи карпо- форов. В участках с отмершим мицелием Fomes pinicola берут перевес различные виды Penicillium, Mucor.

Если в посевном материале есть споры Mucor, то последний в большинстве случаев заглушает даже такие энергичные формы, как Penicillium, не говоря уже о различных базидиомицетах. Коррективом в данном случае могут служить культуры на средах из самой древесины, где обычно наблюдается диффузный рост различных грибов, имеющихся в посевном материале. Просмотр таких культур под лупой позволяет заметить появление отдельных мицелиев, откуда уже легко могут быть сделаны вторичные посевы. Применяя в случае надобности несколько пассажей (предварительных культур), можно добиться выделения форм, заглушаемых при первом посеве на сусло различными быстро растущими плесенями. Диффузный рост грибницы на сравнительно бедных средах из древесины и различных стадий гнили соответствует характеру роста грибов в естественных природных условиях, когда грибница не образует таких компактных колоний, какие обычно развиваются на сусле.

На фильтровальной бумаге грибы развиваются несколько более энергично, чем на средах из древесины. Развивающийся мицелий имеет большей частью характер дерновинок, покрытых бархатистым пушком; некоторые виды выделяют пигмент, придающий окраску бумаге.

Выделение культур на различных питательных средах может служить в известной мере для физиологической характеристики выделенных микроорганизмов. Однако, окончательно их роль в динамике всего процесса может быть выяснена только в результате детальных физиологических экспериментов. Наблюдения же за культурами, с нашей точки зрения, не позволяют делать широкие обобщения о роли этих микроорганизмов в природе, как это часто приходится встречать в литературе.

Так, например, в работе Стапп и Бортельс (29), посвященной разложению лесной подстилки, авторы, отметив, что выделенные ими мицелии грибов могут развиваться не только на клетчатке, но и на других источниках углерода, приходят к заключению, что эти виды не играют существенной роли в разложении клетчатки лесной подстилки, так как они имеют возможность использовать другие, более простые источники улерода (сахара, крахмал). Расщепление же клетчатки, по мнению этих авторов, реализуется в основном целлюлозо-разлагающими бактериями, не способными к усвоению другизГ'источнйков углерода. Такое заключение делает совершенно непонятным, как, например, Fomes pinicola, который на средах с суслом развивается даже лучше, чем на питательной среде с клетчаткой, в природных условиях оказывается одним из энергичнейших разрушителей древесины.

Заканчивая на этом общее описание характера роста различных микроскопических грибов на применявшихся нами средах, переходим к систематическому обзору бактериальной флоры колод.