Бактерии

Методы обнаружения и количественного учета бактерий в почве. Возможность биологических методов учета почвенных бактерий ограничена в том смысле, что не может быть предложено среды, обеспечивающей рост всех почвенных бактерий.

В зависимости от целей исследования для учета бактерий употребляют различные питательные среды: мясо-пептонный бульон (МПБ); МПА, разведенный в 10 раз; МПА пополам с суслом; среду Эшби; среду Гетчинсона; МПА с желтком и т. д. В некоторых случаях необходимо использовать среды, обеспечивающие рост возможно большего количества бактерий, например среды, приготовленные из почвенной вытяжки. Почвенная вытяжка готовится следующим образом: 1 кг садовой почвы заливают 1 л водопроводной воды и помещают в автоклав на 30 мин при давлении 2 атм, после чего дают отстояться. Жидкость сливают и фильтруют через двойной фильтр. Фильтрат нейтрализуют содой до pH 7,2. К 100 мл почвенной вытяжки добавляют 900 мл дистиллированной воды и 15 г агара. Кипятят, разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 30 мин.
При приготовлении почвенного экстракта по Пошону используют плодородную почву с pH, близким к нейтральному. Навеску почвы смешивают с равным количеством водопроводной воды и оставляют стоять 24 ч при комнатной температуре. На следующий день автоклавируют, декантируют и фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр, проверяют pH, стерилизуют. Для получения плотной среды добавляют агар (2%).
Количественный учет бактерий можно проводить методом высева из почвенной суспензии на плотные среды. Однако по целому ряду причин чашечный метод дает заниженные результаты. Очевидно, более перспективными являются методы прямого микроскопического учета бактерий в почве.
Методы прямого микроскопического учета бактерий в почве. Метод Виноградского в модификации Шульгиной состоит в следующем. Тщательно отобранную навеску почвы в 5 г помещают в колбочку объемом 250 мл, содержащую 45 мл стерильной водопроводной воды. Почву перед анализом рекомендуется растирать резиновым пестиком в течение 5 мин. Колбочку энергично встряхивают в течение 5 мин. Суспензию можно обработать ультразвуком или на микроизмельчителе тканей. После 30 с отстаивания наносят одну каплю суспензии на поверхность чистого обезжиренного предметного стекла с помощью пипетки с точно вымеренной величиной капли. Нужно следить, чтобы суспензия в пипетке не оседала и в капле, которую мы наносим на стекло, не скапливалось бы большого количества частиц, для чего все манипуляции нужно проводить быстро и пипетку держать в горизонтальном положении до момента закапывания суспензии. Рядом с каплей суспензии на стекло наносят одну каплю 0,1%-ного агара. На стекле, куда наносят суспензию, предварительно отмечают прямоугольник площадью 8 см2. Нанесенную суспензию равномерно распределяют
по поверхности всего прямоугольника. Для опытов используют тщательно очищенные и обезжиренные стекла. Препарат подсушивают и в течение нескольких минут фиксируют 96%-ным спиртом или парами осмиевой кислоты и окрашивают карболовым эритрозином в течение суток. Следят, чтобы в течение окрашивания препараты не высыхали. Краску смывают, погружая стекла в стакан с водой. Препараты высушивают и с помощью иммерсионного объектива (90Х) проводят подсчет клеток. Необходимо приготовить несколько повторных стекол, не менее пяти. Количество клеток, просчитанных во всех препаратах, суммируют. Расчет количества клеток в 1 г абсолютно сухой почвы N проводят по формуле

где А — общее количество учтенных на стекле клеток, Б — площадь поля зрения в мкм2, вычисленная по формуле яг2, В — объем нанесенной суспензии в мл, Г — количество просчитанных полей зрения, Р — влажность почвы в % к весу сухой почвы.
Одним из наиболее простых и удачных методов выявления, изучения и количественного учета микроорганизмов, в том числе и бактерий, является люминесцентная микроскопия в падающем свете по Звягинцеву с применением в качестве флюорохрома акридина оранжевого.

Почвенную суспензию (1 : 10) после предварительной обработки на ультразвуковой установке переносят в мерный цилиндр на 100 мл. После 2-минутного отстаивания пипеткой отбирают 2 мл суспензии из средней фракции (с отметки 50 мл) и переносят ее в колбу с 18 мл воды. Перед приготовлением препаратов колбу энергично встряхивают. Суспензию наносят микропипеткой на обезжиренные предметные стекла (0,01 мл на препарат) и равномерно распределяют на площади 4 см2 (квадрат 2x2 см). Производят фиксацию с помощью нагревания и окрашивают препарат 2—4 мин водным раствором акридина оранжевого (1 : 10 000). После высушивания препараты просматривают в люминесцентном микроскопе. Из одного почвенного образца готовят два препарата и в каждом просматривают 5 полей зрения. Количество микробных клеток в 1 г почвы вычисляют по формуле

где N — количество клеток в 1 г почвы, а — среднее число клеток в поле зрения, 5 — площадь поля зрения (мкм2), п — показатель разведения. Желательно подобрать разведение таким образом, чтобы среднее число клеток в поле зрения составляло 5—10.
Методы исследования бактерий. Культуральные признаки бактерий обычно описыцают на твердых питательных средах, например на МПА, на кусочках картофеля, моркови и в жидких средах.
Колонии бактерий на твердых питательных средах описывают, отмечая следующие признаки (рис. 41): размер (крупная gt;10 мм в диа-

метре; средняя 1 —10 мм; мелкая, точечная lt;1 мм); профиль (выпуклая, конусоидная, плоская, кратерообразная); край (ровный, лопастной, волнистый, зубчатый, бахромчатый, фестончатый); поверхность (гладкая, бугристая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами, радиально исчерченная); цвет; блеск и прозрачность; консистенция (тестообразная, густая, слизистая, тягучая, жидкая, клейкая); вид колонии под микроскопом (зернистая, однородная, исчерченная)! Колонии смотрят под микроскопом при малом увеличении (с объективом 8Х).
Морфологию бактериальных клеток изучают, приготавливая прижизненные препараты «раздавленная капля» и микроскопируя их при большом увеличении (с объективом 40Х).
Для исследования деталей строения клетки, спор, жгутиков, различных включений приготавливают фиксированные и окрашенные пре-

Рис. 41. Типы бактериальных колоний

параты. Препарат бактерий для фиксации и окраски (мазок) готовят на чистых обезжиренных стеклах. На стекло наносят каплю суспензии бактериальных клеток и размазывают ее тонким слоем с помощью петли или краем покровного стекла. Мазки высушивают при комнатной температуре и фиксируют.
Наиболее распространенный способ фиксации — фломбирование. Стекло с высушенным мазком проводят три-четыре раза через пламя горелки мазком вверх, пока не появляется ощущение жжения при прикладывании стекла к тыльной стороне руки. Для изучения формы клетки этот способ фиксации удовлетворителен. Для исследования тонкого строения бактерий препараты фиксируют химическими веществами, например, спиртом.
После фиксации препарат окрашивают. Существуют различные методы покраски. Наиболее употребительные красители: метиленовый синий, спиртовой или водный раствор; фуксин основной (спиртовой или водно-спиртовой раствор); применяются и более сложные методы покраски с использованием нескольких красителей, например, окраска по Граму, окраска спор по методу Ожешки.
«Негативная окраска» — окраска капсул жидкой тушью проводится так же, как для дрожжей.

<< | >>

↑

Источник: И. П. БАБЬЕВА, Г. М. ЗЕНОВА. Биология почв. 1983

Еще по теме Бактерии:

- Болотоведение - Метеорология и климатология - Научно-популярная история - Океанология (океанография) - Почвоведение -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -