Изучение фотосинтезирующих бактерий

Важным направлением в физиологии микробов в XX в. было изучение способности некоторых групп микроорганизмов к фотосинтезу — фотоли- тотрофии и фотоорганотрофии. Общебиологическое значение изучения фотосинтеза состояло в установлении биохимии и кинетики этого важнейшего биологического явления.

Начало обнаружению разнообразия физиологических особенностей фотосинтезирующих микроорганизмов было положено открытием в середине XIX

в. зеленых бактерий, а несколько позднее — пурпурных. Г. Молиш (1907)

выявил способность пурпурных бактерий расти на органических веществах в темноте и отсутствие выделения ими кислорода. А. Будер (1919)

и В. Бевендамм (1924) высказали предположение, что фотосинтезирующие микроорганизмы способны как к фотосинтезу, так и к хемосинтезу. Исследования К. Ван-Ниля показали, что фотосинтезирующие микроорганизмы осуществляют фотосинтез в присутствии окисляемых субстратов — минеральных и органических — и без выделения кислорода. Он же составил уравнение бактериального фотосинтеза:

СОг + 2НгА СНгО + НгО -J- 2А.

Исследованиями К. Ван-Ниля (1936), а позднее X. Гаффрона, Дж. Фостера и Д. И. Сапожникова было показано, что специфичность бактериального фотосинтеза определяется именно природой доноров водорода (электрона). Органические соединения могут выполнять функции либо источника водорода (электрона), либо углерода, либо обе эти функции одновременно. Те же функции (иногда в присутствии сульфидов и тио- сульфатов) могут нести кислоты цикла Кребса.

В ходе изучения пигментов фотосинтезирующих бактерий, начавшегося с открытия в 1952 г. Г. Шахманом, А. Парди и Р. Стениером хро- матофоров, было установлено, что они являются мембранными структурами — ламеллами, которые за уплощенную форму были названы С. Менке (1962) тилакоидами. Среди них были дифференцированы ла- меллы. стромы и ламеллы гран, в которых сконцентрированы бактерио- хлорофиллы. Таким образом, в 50—60-е годы стало известно, что фотосинтезирующий аппарат микроорганизмов представляет собой фосфолипо- протеиновую структуру и содержит пигменты и переносчики электронов, т. е. дыхательную цепь. Иными словами, система энергетического обмена дополнена у них системой фотосинтезирующих пигментов.

Изучение азотфиксирующих бактерий

Видное место в развитии физиологии микроорганизмов заняли исследования азотфиксирующих микроорганизмов.

В 1901 г. М. Бейеринк и в 1903 г. Дж. Липман выделили три аэробных азотфиксатора — Azotobacter chroococcum, A. agile и A. vinelandii. Позднее азотфиксирующая способность была открыта более чем у 80 видов бактерий, у нескольких видов актиномицетов, спирохет, дрожжей и дрожжеподобных организмов, плесневых и микоризных грибов, а также более чем у 40 видов синезеленых водорослей.

Основную роль в открытии столь широкого распространения способности к азотфиксации и в установлении ее биохимии сыграло применение изотопа азота — 15N. Последовательная смена воззрений на химизм азотфиксации была следующей. Еще до открытия возбудителей азотфиксации А. Готье и Ш. Друэн (1888) предположили, что в процессе связывания азота молекулярный азот сначала окисляется в азотистую, а затем в азотную кислоту. В 1893 г. С. Н. Виноградский высказал мысль о том, что азот восстанавливается выделяющимся водородом с образованием аммиака. Открытие аэробного A. chroococcum было косвенным подтверждением возможности окислительного пути.

Более распространенной, однако, оказалась гипотеза о восстановительном характере процесса. При этом предполагалось либо непосредственное связывание азота с дикарбоновыми кислотами, превращающимися в аминокислоты (М. Герлах, Дж. Фогель, 1902; Дж. Липман, 1903); либо, согласно теории Г. Виланда (1922; Нобелевская премия, 1927), присоединение молекулой азота атома водорода с образованием диимида и гидразина; либо, согласно взглядам С. П. Костычева (1925—1931), фиксация молекулярного азота азотобактером происходит внеклеточно путем присоединения водорода к азоту при участии восстановительных ферментов; либо, наконец, по С. Н. Виноградскому (1930), молекулярный азот восстанавливается водородом до аммиака (гидрогенизация). Наряду с этим существовала гипотеза (Д. Блом, 1931), что промежуточным продуктом фиксации является гидроксиламин. Эта идея получила затем развитие в лаборатории А. Виртанена (40-е годы; Нобелевская премия, 1945), который полагал, что гидроксиламин, соединяясь с щавелевой кислотой, образует оксим, превращающийся затем в аспарагиновую кислоту. Эта гипотеза была проверена П. Вильсоном (1954) и не получила подтверждения.

В 1941 г. в исследованиях Р. Бёрриса и Ч. Миллера при изучении фиксации молекулярного азота впервые был использован тяжелый изотоп 15 N. Эти ученые экспериментально показали, что первым устойчивым продуктом азотфиксации является аммиак. Этот же факт был установлен и на бесклеточных ферментных системах (JI. Мортенсон и др., 1962; Д. Карнахан и др., 1963; А. А. Имшенецкий и др., 1963; и др.). Однако механизм восстановления N2 до NH3 до сегодняшнего дня остается предметом исследований. В настоящее время известно, что участвующие в азотфиксации ферменты представляют собой систему белковых катализаторов, содержащих в своем составе молибден и железо. В клубеньковых бактериях имеется аналогичный фермент — легоглобинг катализирующий перенос кислорода. Для активного функционирования этих ферментов необходим витамин Біг (В. JI. Кретович, В. А. Яковлев и др.),

Важный научный материал был получен также в результате исследований таких почвенно-микробиологических процессов, как денитрификация, нитрификация, окисление серы, разложение различных органических соединений и многих других процессов, представляющих собой различные формы получения энергии в мире микроорганизмов.

Современный этап в развитии микробиологии

Для развития общей микробиологии в последние десятилетия характерна все более углубляющаяся дифференциация, приводящая к выделению новых самостоятельных направлений. Наряду с продолжающимся развитием экологического направления, связанного с изучением разнообразия мира микробов, принципов и методов их систематики, изучением морфологических, цитологических и цитохимических особенностей микробной клетки шло развитие физиологии микроорганизмов. Оно касалось не только изучения уже названных физиологических свойств микроорганизмов на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях, но и способности отдельных групп микроорганизмов синтезировать биологически активные вещества, белки и аминокислоты, а также подвергать молекулярной трансформации сложные органические соединения.

Следует отметить, что увлечение исследованиями биохимии микробиологических процессов привело к некоторому стиранию граней между биохимией, физиологией и общей микробиологией, к утрате последней ее научной специфики и конкретности в определении научных задач. Оно сопровождалось также некоторым отвлечением внимания ученых от выяснения специфики микроорганизмов как живых биологических объектов. Сложившаяся в общей микробиологии ситуация явилась предметом детального обсуждения на XI Международном микробиологическом конгрессе в Мексике (1970).

Практическое использование

биосинтетической и трансформирующей деятельности

микробов

С начала второй половины XX в. изучение синтетической и трансформирующей деятельности микроорганизмов ведется в тесном контакте с их селекцией и широким практическим использованием.

Главными продуктами биосинтетической активности микроорганизмов являются белки, витамины, гиббереллины, полисахариды, аминокислоты, ферменты, энтомопатогенные препараты, кормовые антибиотики. Непременным условием успешного развития этого направления стало ведение ?селекционной работы — получение и использование высокоактивных штаммов продуцентов, обеспечивающих рентабельность производства. Развитие селекции опирается на теоретический фундамент генетики. За ?сравнительно короткий срок (примерно 20 лет) при помощи селекционногенетических методов были созданы многие высокоактивные штаммы микробов, продуктивность которых была повышена в 10—200 раз по сравнению с исходными штаммами. Их использование явилось предпосылкой создания ряда отраслей микробиологической промышленности. Классическим объектом селекции стали актиномицеты и грибы.

Начало изучения и использования биосинтетической деятельности микроорганизмов связано с получением пенициллина, который в 1940 г. Г. Флори и Э. Чейн выделили из культуры плесневого гриба, впервые ?описанного А. Флемингом в 1929 г. (совместная Нобелевская премия, 1945). Этот продуцент был идентифицирован М. Тома как Penicillium notatum. Однако родоначальником всех высокоактивных штаммов продуцентов пенициллина, используемых в настоящее время, стал P. chryso- .gennm.

Существенными нововведениями в производстве пенициллина, значительно повысившими его выход, были: переход с поверхностного выращивания гриба на глубинное (этот новый тип промышленного культивирования приобрел большое значение не только для пенициллиновой, но и для всей микробиологической промышленности); перевод процесса биосинтеза с синтетических питательных сред на богатые питательными веществами среды; введение в ферментационную среду предшественника продукта биосинтеза — осколка пенициллиновой молекулы — фенилуксус- Ной кислоты. Все эти факторы значительно усилили физиологическую активность продуцентов терапевтически наиболее ценного типа пенициллина — бензилпенициллина.

Культура актиномицета — продуцента стрептомицина была впервые выделена в 1914 г. А. Краинским, который подробно описал морфологические и физиологические особенности этого гриба, назвав его Actinomyces griseus. В 1916 г. 3. Ваксман и Р. Куртис выделили другой ак- тиномицет, сходный с предыдущим, отнеся его также к виду Act. griseus. После этого поиски новых продуцентов антибиотиков были возобновлены только в 1943 г., уже после открытия пенициллина и после того, как в 1940 г. 3. Ваксман и X. Вудраф обнаружили у двух видов актиноми- цетов способность образовывать антибиотические вещества. В 1944 г. Ваксман выделил еще две культуры, продуцирующие стрептомицин (Нобелевская премия, 1952).

В 40—50-е годы у микроорганизмов была открыта способность синтезировать и другие антибиотики: окситетрациклин (Act. rimosus, 1948), аурэомицин (биомицин; Str. aureofaciens, 1948), эритромицин (Act. eryth- reus, 1952), олеандомицин (Act. antibioticus, 1956), грамицидин (Вас. brevis) и т. д. По отношению ко всем продуцентам названных антибиотиков, а также таких антибиотиков, как ванкомицин, ристомицин, кана- мицин, гризеофульвин, альбомицин, целикомицин, для повышения активности продуцента были применены различные методы селекции.

Столь же успешно исследовалась способность микроорганизмов к синтезу аминокислот. Начало промышленного микробиологического синтеза аминокислот относится к 60-м годам, когда в Японии в результате обработки УФ-лучами исходных штаммов Micrococcus glutamicus, выделенного из почвы (С. Киношита, 1956), были получены штаммы, обладавшие высокой биосинтетической активностью. Изучение механизма синтеза аминокислот, вопросов взаимозаменяемости и конкурентности природных аминокислот и их аналогов позволило значительно глубже проникнуть в содержание физиолого-биохимических процессов, протекающих в микробных клетках. Были установлены явления ретроингибирования, аллосте- рического торможения при образовании аминокислот, определены места блокирования отдельных этапов биосинтеза у биохимических мутантов, установлены взаимные связи и перекрещивания синтезов различных аминокислот, роль предшественников и т. д.

Изучение биосинтетических путей образования аминокислот микроорганизмами и их селекция интенсивно проводились в течение последнего десятилетия в лабораториях многих стран мира. Микробиологическим путем стали получать аланин, аспарагиновую и глутаминовую кислоты, лизин, метионин, триптофан, лейцин, изолейцин и т. п. По данным С. Киношита (1959) и Н. А. Красильникова (1963), чаще всего в природе встречаются продуценты глутаминовой кислоты и аланина. Анализ путей синтеза аминокислот в клетках показал, что для микроорганизмов характерно восстановительное аминирование пировиноградной кислоты при использовании таких источников углерода, как глюкоза, кислоты цикла Кребса, глицерины, углеводороды; источником аминогруппы является глутаминовая кислота. Образование аланина связано с функционированием аланиндегидрогеназы, обладающей специфичностью по отношению к субстрату и по ответной реакции на воздействие стимулирующих и инактивирующих агентов.

Аспарагиновая кислота, играющая исключительно важную роль в процессах обмена, довольно часто, хотя и в небольших количествах, обнаруживается в культуральной жидкости многих микроорганизмов. Для аспарагиновой кислоты, так же как и для глутаминовой, валина и аланина, характерен синтез путем использования предшественников кетоана- логов и их последующего перевода в аминокислоты ферментными системами клеток. В Японии налажено промышленное производство аспарагиновой кислоты микробиологическим методом на основе превращения фумарата в аспарат Е. coli. При изучении образования глутаминовой кислоты у Pseudomonas ovalis были обнаружены два самостоятельные пути ее синтеза — восстановительное аминирование а-кетоглутаровой кислоты и переаминирование.

Наиболее рациональным способом промышленного биосинтеза лизина оказалось использование мутантов с наследственными нарушениями в цепи превращений аспарагиновой кислоты — исходного продукта для биосинтеза многих аминокислот — лизина, метионина, треонина, изолейцина. В результате сочетания биохимических и генетических методов исследования были получены штаммы, синтезирующие 25—30 мг/мл лизина.

Большое внимание уделялось изучению путей микробиологического синтеза кормового белка. В качестве субстрата для выращивания проду центов — главным образом дрожжей рода Candida — используются углеводороды ж гидролизаты растительных отходов. Не менее интенсивно велись поиски возможности использования биосинтетической деятельности микробов для получения препаратов различных ферментов. Основными продуцентами ферментов являются грибы рода Aspergillus, а также некоторые бактерии и актиномицеты.

В небольшом количестве получают амилолитические и протеолитиче- ские ферменты и пектиназы. Достаточно хорошо изучены условия биосинтеза таких ферментов, как лактаза, целлюлаза и гемицеллюлазат фибринолитические ферменты, глюкозооксидаза, нуклеодеполимеразьь и Др.

Активность ферментов повышают подбором штаммов и условий культивирования, а также методами селекции. Работы в этом направлении широко ведутся в СССР, Японии, США и других странах.

Интенсивное развитие получил также микробиологический синтез органических кислот — лимонной, итаконовой, щавелевой, глюконовой,— наиболее активными продуцентами которых являются аспергиллы; гиб- береллинов, основным продуцентом которых служит культура Fusarium moniliforme; витаминов — витамина В2 (рибофлавина), витамина В)2 и эр~ гостерина. Выяснилось, что способностью к синтезу витамина В2 обладают дрожжи рода Candida, а также некоторые грибы (Ashbya gossypii, Asp., flavus и Asp. niger) и актиномицеты (Act. olivaceus); продуцентами витамина Біг являются пропионовокислые бактерии, Act. olivaceus, а также микробный комплекс метанового биоценоза, практическое использование которого было разработано в нашей стране (В. Н. Букин, В. Я. Быховский, Е. С. Панцхава и др.). Обработка названных продуцентов мутагенными факторами и последующий отбор дали возможность значительно увеличить синтез ими витамина В12.

За последние годы разностороннему изучению и широкому практическому использованию подверглась трансформирующая активность микроорганизмов. Способность некоторых групп микроорганизмов к тонкой трансформации химических соединений, затрагивающей только один-два атома, нашла применение в тех случаях, когда современная химическая технология еще бессильна. Теоретическую основу развития этого важнога раздела физиологии микробов составили идеи В. JI. Омелянского, указывавшего на высокую точность и специфичность деятельности микроорганизмов. «Самые разнообразные реакции окисления и восстановления, гидратации и дегидратации, реакции разложения, полимеризации и атомных группировок,— писал Омелянский,— вызываются микроорганизмами с поразительной легкостью, приводя к глубоким изменениям подвергнутого их воздействию субстрата» !.

Микробиологическую трансформацию используют главным образом для получения из стероидного сырья растительного происхождения веществ, обладающих фармацевтическими или гормональными свойствами. Поиски в природе микроорганизмов — трансформаторов стероидной молекулы, способных осуществлять тончайшие реакции (гидроксилирования, дегидрогенизации, дезацетилирования, восстановления и т. п.), ведут по двум направлениям: обнаружение в природе таксономических групп, способных производить ту или иную трансформацию, и выделение методами селекции наиболее активных штаммов. Так были найдены штаммы некоторых грибов, способные осуществлять трансформацию с выходом корти зона и гидрокортизона, актиномицеты и микобактерии, применяющиеся для получения преднизона, преднизолона, диакобала, культуры грибов и микобактерий, селективно дезацетилирующие стероидные соединения.

Исследования трансформирующей активности микроорганизмов основывались на углубленном изучении их физиологии и интенсификации нужных ферментативных процессов. Были найдены также коррелятивные связи между морфологическими свойствами и химической активностью и установлена возможность подбором соответствующих условий (например, окислительно-восстановительных) и усилением нужной ферментативной активности микробов направлять процесс трансформации.

Проблема управляемого культивирования

В последние десятилетия XX в. одной из интенсивно развивающихся проблем микробиологии стала проблема управляемого культивирования. Теоретической основой возникновения и развития этого направления явилось детальное изучение большого разнообразия физиологических потребностей микроорганизмов. Результаты физиологических исследований позволили с помощью соответствующих условий культивирования регулировать ход бродильных и ферментационных процессов, накапливать микробную массу с заданными свойствами, воздействовать на ход микробиологических процессов.

Разработка проблемы управляемого культивирования восходит к исследованиям более раннего периода (20-е годы), направленным на поиск методов изменения хода обмена веществ микроорганизмов с помощью разнообразных факторов внешней среды.

Впервые на принципиальную возможность управлять развитием культуры с помощью условий среды указал Г. Клебс (1905), которому удалось таким образом регулировать развитие грибов и водорослей. Существенное значение имели работы М. Кларка (30-е годы), а в СССР — исследования школы Е. Е. Успенского — С. И. Кузнецова (30—50-е годы), развивавшие представление о том, что одним из центральных звеньев превращения веществ являются реакции окисления-восстановления. Полученные ими данные легли в основу представлений об управлении обменом веществ микроорганизмов с помощью изменения различных окислительно-восстановительных условий среды (И. JI. Работнова). Важную роль сыграла также теория двухфазности бродильных процессов, разработанная В. Н. Шапошниковым в 50-е годы.

В 50-е годы XX в. учеными разных стран была разработана теория роста и развития микробов (М. Стефенсон, И. Гунсалус, Н. Д. Иерусалимский, Ж. Моно, В. Шеффер, Р. Финн и др.). Было, в частности, показано, что процесс роста культуры — изменение ее биомассы и численности клеток — сопровождается изменениями структуры клеток, их химического состава и физиологической активности и соответствует физиологическому возрасту культуры. Поэтому регуляция физиологического состояния культуры сводится по существу к регуляции скорости ее роста, осуществляющегося под контролем внутриклеточных механизмов, реагирующих на изменение среды.

В свете этих фактов были разработаны теоретические основы управления ростом микробов, опирающиеся на принцип минимума («узкого места»), т. е. использование функции лимитирующего вещества (Ж. Моно, А. Новик, JI. Сцилард и др.), а также на регулирование величины популяции и накопления продуктов жизнедеятельности. Полученные дан-

Турбидостат Моно (Б) и схема проточной установки (А) по Моно (1950)

ные позволили найти практические методы управляемого культивирования микробов, в том числе метод непрерывного, или проточного, культивирования, теоретическое обоснование которого было дано Ж. Моно в 1950 г.

Метод состоит в подаче в культиватор с постоянной скоростью питательной среды и непрерывном выводе с такой же скоростью культуральной среды с бактериями. Точный контроль за непрерывным культивированием микробов осуществляется в аппаратах типа турбидостата, обеспечивающего контроль за плотностью биомассы микроба, либо типа хемостата, позволяющего контролировать скорость увеличения концентрации лимитирующего фактора.

Значительное повышение точности физиологических исследований за счет обеспечения постоянства условий среды и состояния культуры определило широкое использование метода непрерывного культивирования в последние годы.

Основные этапы развития генетики микроорганизмов

В 40—50-е годы XX в. из общей микробиологии выделилось самостоятельное направление — генетика микроорганизмов — с наиболее важным разделом — генетикой бактерий. Основой исключительно быстрого развития этой области исследований послужили доказательства мутационной

природы изменчивости микроорганизмов, обнаружение у них различных •форм генетической рекомбинации и роли ДНК в их наследственных свойствах, достоинства микроорганизмов как объектов генетических исследований. Генетика микроорганизмов приобрела особое значение в связи с решением кардинальных проблем молекулярной биологии. Исследования структуры ДНК, ее роли в процессах биосинтеза белка и регуляции внутриклеточных обменных процесов, разработка проблем направленной изменчивости и специфичности мутагенеза ведутся в основном на микроорганизмах.

До оформления генетики микроорганизмов в самостоятельную отрасль знания генетики и микробиологи работали разобщенно. Микробиологи были далеки от генетического истолкования наблюдавшихся ими фактов изменчивости и наследственности микробов, а генетики либо вообще не интересовались бактериологией, либо скептически относились к возможности применения генетических принципов к таким примитивно организованным формам жизни, какими им представлялись бактерии.

Первый этап в развитии генетики бактерий составили исследования, экспериментально доказывающие сходство природы и механизмов передачи потомству наследственных признаков у бактерий и высших организмов.

До выделения генетики бактерий в самостоятельную дисциплину существовало несколько точек зрения на популяционную изменчивость бактерий. Согласно одной из них, все изменения, вызванные внешней средой, являются непосредственно адаптивными. Это воззрение основывалось на представлении о наличии у бактерий повышенной врожденной пластичности, позволяющей им адэкватно реагировать на разнообразные условия внешней среды. Длительному сохранению в микробиологии этого взгляда способствовал тот факт, что работа с бактериями велась, как правило, на больших популяциях, быстро размножающихся бесполым путем, что затрудняло контроль за изменчивостью отдельных особей. Вследствие этого изменения наследуемых признаков в единичных клетках оставались не обнаруженными до тех пор, пока такие измененные клетки не размножались в достаточно большом количестве, чтобы образовать целую популяцию.

Согласно другой точке зрения, изменчивость бактерий является результатом длительных модификаций, не затрагивающих наследственной основы организма и проявляющихся в течение многих поколений после того, как вызвавший их фактор перестал действовать. Третья точка зрения сводилась к признанию полицикличности в развитии бактерий, проявлением которой служат изменения их признаков. Эти взгляды означали реставрацию идеи полиморфизма, утверждавшей наличие в мире микробов безграничной изменчивости.

Лишь немногие микробиологи склонялись в четвертой точке зрения, согласно которой причиной изменчивости бактерий могут быть спонтанные изменения (мутации) в одной или нескольких клетках, подвергающиеся отбору. Зачатки подобных представлений содержались, например, в работах М. Нейсера (1906) и Р. Массини (1907), описавших факт внезапного наследственного приобретения культурой Escherichia coli свойства активно сбраживать лактозу. Низкая частота и стабильность этого нового признака позволили авторам получить новый штамм и отнести это явление к категории мутаций, полученных Г. де Фризом. Этим же термином воспользовался и М. Бейеринк при объяснении причин происхождения «дочерних» узелков на поверхности бактериальной колонии. В 1912 г. К. Добелл определил мутации у бактерий как стойкие, иногда незначительные изменения, передающиеся по наследству.

В период с 1910 по 1940 г. были описаны различные виды наследственной изменчивости. В 1921 г. французский микробиолог П. де Крюи описал изменение ряда свойств у одной из патогенных бактерий, возникающее, по его мнению, в результате расщепления признаков под влиянием неблагоприятных условий среды. Этот вид изменчивости он назвал диссоциацией. В 1925 г. в Советском Союзе Г. А. Надсон и Г. С. Филиппов впервые получили мутационные (по их терминологии, сальтацион- ные) стойкие изменения признаков у дрожжевых и плесневых грибков, подвергнув их облучению рентгеновыми лучами. Это был первый случай индуцированной мутации, вызванной физическим мутагенным фактором. Первые данные о характере мутаций позволили провести параллель между природой изменчивости у бактерий и высших организмов. Это стало возможным также после того, как были разработаны методы, которые дали возможность отличать изменения отдельной клетки от изменчивости целой популяции.

Причины различий в объяснении фактов изменчивости у микробов носили преимущественно методологический характер. Из-за отсутствия единой методики эксперимента данные разных авторов оставались несопоставимыми. Трудности в разграничении фенотипа и генотипа приводили зачастую к отрицанию различий между адаптацией и мутацией. Случаи морфологической изменчивости, требующие длительного наблюдения, нередко объясняли наличием сложных циклов развития. Длительное время отсутствовали и единые методы генетического анализа, в частности, принцип отбора мутантов.

Значительное упорядочение представлений о природе изменчивости у микробов было связано с разработкой методов генетического анализа у высших организмов и утверждением представлений о сходстве механизмов изменчивости и наследственности у всех живых организмов.