Метод неферментативного определения лактата и пирувата в одной пробе крови.  

Условия взятия образца крови, хранения и исследования такие же, как и при определении лактата.

Реактивы: 10%-ный раствор Н2РО3.

25%-ный раствор C11SO4 • 5НгО;

10%-ный раствор C11SO4 • 5Н2О;

Са(ОН)2 в порошке (ч. д. а.);

концентрированная H2SO4;

20%-ный спиртовой раствор гидрохинона;

раствор п-диметиламинбензальдегида (п-ДБА): 500 г п-ДБА в 60 мл метилсульфоксида, дистиллированная вода до 100 мл;

25%-ный раствор NaOH.

Оборудование: водяные бани на 37 °С и 100 °С; центрифуга ОПН-8; спектрофотометр СФ-46; центрифужные пробирки; пробирки с притертыми пробками; пипетки.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят

6. мл дистиллированной воды и 1 мл взятой крови, 1 мл 10%-ного раствора Н2РО3, хорошо встряхивают и оставляют на 2 мин для осаждения белков. Центрифугируют 5 мин при 2000—3000 мин-1. Прозрачную надосадочную жидкость переносят в чистую центрифужную пробирку, приливают 1 мл 25%-ного раствора C11SO4 и вносят 0,5 г Са(ОН)2, тонко растертого до порошка. Стеклянной палочкой перемешивают пробы, пока голубая окраска не перейдет в синюю. Через 30 мин центрифугируют пробу 10 мин при 2000—3000 мин 1. Полученный безбелковый центрифугат переносят в градуированную пробирку для определения коэффициента К измерения объема анализируемого раствора:

К= V/v,

где V — общий объем анализируемого раствора (кровь, вода, осадители белков и углеводов), мл; v — объем безбелкового и безуглеводного центрифугата, мл.

Для определения пирувата (Р) в центрифужную пробирку вносят 1 мл анализируемого раствора (в контроль — 1 мл воды), 3 мл реактива п-ДБА и 1 мл 25%-ного раствора NaOH. Тщательно перемешивают реакционную смесь и помещают в водяную баню при 37 °С на 45 мин.

Во время термостатирования смеси с пируватом параллельно определяют содержание лактата.

  Рис. 2. Калибровочные кривые для определения лактата и пирувата:

По оси абсцисс — концентрация (ммоль/л) лактата (сплошная линия), концентрация (мкмоль/л) пирувата (пунктирная линия); по оси ординат — оптическая плотность, относительные единицы

(в контроль — 1 мл воды), добавляют по 0,1 мл 10%-ного раствора C11SO4 и осторожно по стенке приливают по 4 мл концентрированной H2SO4, хорошо закрывают пробкой во избежание испарения образовавшегося в результате реакции ацетальдегида. Смесь помещают в кипящую водяную баню на 1,5 мин. После кипячения и охлаждения вносят 0,1 мл спиртового раствора гидрохинона,перемешивают, повторно помещают в кипящую водяную баню на 15 мин и охлаждают. Охлажденный раствор колориметрируют при длине волны 430 нм против контроля. Содержание лактата рассчитывают по калибровочной кривой с учетом коэффициента К (рис. 2).

По истечении 45 мин термостатирования реакционную смесь с пируватом центрифугируют при 2000—3000 мин-1 и осторожно переносят надосадочную жидкость в спектрофотометрические кюветы для определения оптической плотности анализируемого раствора (при 420 нм) против контроля. Концентрацию пирувата рассчитывают по калибровочной кривой с учетом коэффициента К.

Для построения калибровочных графиков используют растворы лактата и пирувата с разведением 1 : 8, обрабатывая их аналогично центрифугату. Концентрацию лактата и пирувата в крови рассчитывают путем умножения величин, полученных по калибровочным кривым, на коэффициент К.

Источники: 8, 16, 33.