Определение пировиноградной кислоты по модифицированному методу Фреедмана и Хаугена. 

Реактивы: 7,5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты. Готовят небольшое количество, хранят в холодильнике. Старые растворы использовать нецелесообразно;

толуол чистый (перегнанный);

0,1 %-ный раствор 2,4-динитрофенилгидрозина в 2 моль/л растворе соляной кислоты. 100 мг 2,4-динитрофенилгидрозина растворяют в 100 мл 2 моль/л раствора соляной кислоты. Кислоту добавляют небольшими порциями и нагревают на водяной бане до полного растворения 2,4-динитрофенилгидрозина. Раствор фильтруют и хранят в холодильнике в склянке из темного стекла;

10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты;

10%-ный раствор натрия карбоната;

5. моль/л раствор натрия гидроксида;

2 моль/л раствор соляной кислоты;

основной раствор пировиноградной кислоты. 20 мг пировиноградной кислоты или 25 мг натрия пировинограднокислого растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл;

стандартный 1 мг%-ный раствор пировиноградной кислоты. Готовят перед анализом из основного раствора; 5 мл основного раствора пировиноградной кислоты или натрия пировинограднокислого в мерной колбе доводят дистиллированной водой до 100 мл.

Оборудование: ФЭК; химические пробирки с притертой пробкой; водяная баня.

Ход определения. Осаждение белков крови. Для получения цельной крови в качестве стабилизатора (антикоагулянта) используют натрия фторид из расчета 100 мг на 10 мл крови.

Образование 2,4-динитрофенилгидрозона пировиноградной кислоты. В пробирку с притертой пробкой вносят 1 мл безбелкового фильтрата крови и помещают в водяную баню при температуре 25 °С на 10 мин. Добавляют 0,25 мл 0,1 %-ного раствора 2,4-динит- рофенилгидрозина. Пробу выдерживают 10 мин при комнатной температуре (для образования гидрозина пировиноградной кислоты).

Экстракция 2,4-динитрофенилгидрозона пировиноградной кислоты. К реакционной смеси добавляют 2 мл толуола, пробирку закрывают пробкой и содержимое ее тщательно встряхивают в течение 3 мин. Пробу на 10 мин оставляют для расслоения жидкости. После этого осторожно с помощью шприца и пипетки удаляют нижний водяной слой. К толуоловому экстракту добавляют 1,5 мл 10%-ного раствора натрия карбоната и хорошо взбалтывают, снова дают разделиться слоям жидкости. На этом этапе гидрозон пировиноградной кислоты переходит в содовый раствор.

Колориметрирование. Из нижнего содового раствора отбирают 1,25 мл, вносят в чистую пробирку, прибавляют 1,25 мл 1,5 моль/л раствора натрия гидроксида. При этом развивается красно-бурая окраска, специфичная для 2,4-динитрофенилгидрозона пировиноградной кислоты. Через 20 мин проводят фотометрирование в кювете с толщиной слоя 5 мм при длине волны 465 нм (синий светофильтр) против контроля.

Контроль готовят так же, как опытную пробу, только без крови. В качестве контроля может быть использован 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты.

Параллельно проводят обработку калибровочного раствора пировиноградной кислоты или натрия пировинограднокислого, содержащего 1 мг% пировиноградной кислоты, так же, как и пробу крови.

Расчет ведут по формуле

где х — количество пировиноградной кислоты на 100 мл крови, мг; А — экстинкция опытной пробы; В — экстинкция калибровочной пробы; 1 — содержание пировиноградной кислоты в стандартной пробе, мг%.

При переводе мг% в мкмоль/л полученную величину умножают на 113,6.

Расчет можно проводить по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору пировиноградной кислоты или натрия (лития) пировинограднокислого и содового раствора.

Клиническое значение. Пировиноградная кислота — промежуточный продукт углеводного и белкового обменов. Она тесно связана с обменом тиамина. Тиамин в форме тиаминдифосфата является коферментом декарбоксилаз, участвующих в окислительном декарбоксилировании пировиноградной кислоты. При недостатке тиамина в крови и моче повышается концентрация пировиноградной кислоты со всеми последующими патологическими явлениями. Нормальное содержание пировиноградной кислоты в крови колеблется от 0,6 до 1,7 мг%, или от 68 до 193 мкмоль/л (см. приложение 5). Ее содержание в крови повышается при гиповитаминозе Вх, нарушении окислительно-восстановительных процессов в условиях дефицита кислорода, болезнях печени, кетозе и т. д.

Источник: 48.