Определения содержания нитратов в растительной продукции.

Повышенное накопление нитратов в растениях может быть не только при высоких дозах минеральных азотных удобрений, но и при внесении высоких доз органических удобрений, а также иа высокогумусированных почвах, если создаются благоприятные условия для минерализации органического вещества и мобилизации почвенного азота.

Нитраты и нитриты являются естественными компонентами растений, начальным звеном в биосинтезе белка. Использование нитратного азота в метаболизме органических веществ возможно лишь после восстановления нитратов до аммония. Первым промежуточным продуктом восстановления нитратов являются нитриты. Растения, накапливая нитраты и нитриты в больших количествах, не страдают от их избытка, но эти соединения весьма токсичны для человека и животных, особенно опасны нитриты, токсичность которых в 10 раз выше, чем нитратов. Нитриты в организме человека и животных переводят двухвалентное железо гемоглобина в трехвалентное. Образующийся при этом метагемоглобин не способен переносить кислород. Нитриты могут вступать в необратимую реакцию с гемоглобином, образуя нитрозогемоглобин, который тоже не способен переносить кислород, в результате чего наблюдается кислородное голодание тканей живого организма. Кроме того, нитриты в кислой среде реагируют со вторичными аминами, образуя шлрозоамины. Эти соединения наиболее опасны для человека и животных, так как обладают канцерогенными, мутагенными и эмбриотропными действиями на организм. На восстановление нитратов в растениях влияют не столько дозы азота, сколько освещение, агротехника, соотношение питательных веществ, погодные условия, преобладание азота над фосфором и калием в почве, дождливая погода способствует накоплению нитратов в растениях.

Уровень накопления нитратов и нитритов в растениях также зависит от форм применяемых удобрений (азотных), биологических особенностей растений и фазы развития. В процессе вегетации содержание нитратов в растениях, как правило, снижается, поэтому убирать их, особенно овощные культуры, необходимо в оптимальные

Допустимое содержание нитратов в растениях (ПДК)

Снижению содержания нитратов способствует также оптимальный световой режим, выбор дет, форм, сроков и способов применения удобрений, а также сбалансированное минеральное питание растений.

Повышенное содержание нитратов в овощах и кормах препятствует их использованию в пищу человеку и животным. Поэтому необходим строгий контроль за содержанием нитратов и нитритов в растениеводческой продукции.

Для нитратов и нитритов установлены предельно допустимые концентрации (ПДК) в растениях - в плодах, овощах и кормах. Это содержание NO}' мг на 1 кг сырой продукции (см. таблицы).

Для определения содержания нитратов в растениях разработан ряд методов. Наибольшее распространение получил в настоящее время и принят стандартным ионометрический экспресс-метод.

Ионометрический метод определения нитратов позволяет проводить экспресс-анализ овощей, зеленых кормов, сена, силоса, сенажа, витаминной муки, корнеплодов и т.д.

Нитраты извлекают раствором алюмокалиевых квасцов с последующим измерением концентрации нитратов в растворе с помощью ионселективиого электрода. Данный метод не пригоден при содержании в анализируемом материале хлоридов в концентрации, в 50 раз превышающей концентрацию нитратов. Чувствительность метода 6 мг/дм3. Предел определения нитратов в сухом образце - 300 мл'1, в сыром - 24 -30 мл'1. Ошибка метода ± 12 %.

Аппаратура. Для проведения анализа применяют: иономер типа ЭВ-74, pH-милливольтметр pII-340, pH-121, pH-150 или аналогичные приборы с погрешностью измерения ±5 мв/±0.06 рС NOI-

Электроды: ионселективные типа 3M-NO3-0l, ЭМИ-11 и электрод сравнения - хлорсеребрянный, насыщенный образцовый 2-го разряда по ГОСТ 17792-72.

Оборудование: весы лабораторные (до 500г), колбы мерные на 50 и 100 мл, скальпель, мезгообразователь, ротатор, гомогенизатор (6000 об/мин), терка, фарфоровая ступка. Реактивы

квасцы алюмокалиевые по ГОСТ 4329-77 ч.д.а.

калий хлористый по ГОСТ 4234-77 х.ч.

калий азотнокислый по ГОСТ 4217-77 х.ч.

дистиллированная вода. Ход анализа. Сухой растительный материал предварительно размолоть на лабораторной мельнице до полного прохождения через сито 1 мм. Навеску материала - 1 г с точностью + 0,01 - помещают в колбу 100- 200 мл, приливают 50 мл 1%-го раствора алюмокалиевых квасцов и взбалтывают на ротаторе в течение 3 мин. В полученной суспензии определяют концентрацию нитрат-ионов. При анализе сырого материала образец предварительно измельчают до размера частиц не более 1 см. Навеску материала 10 г с точностью ±0.1 помещают в стакан гомогенизатора, приливают 50 мл 1%-го раствора алюмокалиевых квасцов (соотношение 1:5) и

гомогенизируют в течении 1 мин при 6000 об/мин. При отсутствии гомогенизатора, сырой материал, содержащий твердые ткани, растирают в ступке с прокаленным песком или с битым стеклом до однородной массы и переносят с помощью 50 мл 1%-го раствора алюмокалиевых квасиов в коническую колбу на 100-200 мл и встряхивают на ротаторе в течение 3 мин. В полученной суспензии определяют содержание нитратов.

При определении нитратов в растениях семейства крестоцветных при рСцог в суспензиях менее 2.5 ед. необходимо разведение в 20 раз, а при pCNO]- от 2.5 до 3.0 - в 10 раз. Для этого суспензию фильтруют через бумажный фильтр, берут 2 мл фильтрата и добавляют 38 мл 1%-го раствора алюмокалиевых квасцов при двадцатикратном разбавлении, и соответственно 4 и 36 мл - при десятикратном. В разбавленном фильтрате измеряют концентрацию нитратов. Измерение концентрации ниграт-иона проводится в единицах pCNOr (pCNOj- = -log (CNOr)) по шкале иономера, предварительно отградуированной по растворам сравнения или в милливольтах с последующим определением величины pCNOr по градуировочному графику, построенному по результатам измерения ЭДС электронной пары в растворах сравнения. Перед измерением нитратный ионселективный электрод тщательно ополаскивают дистиллированной водой и выдерживают в ней 10 мин. Измерение концентрации иона нитрата в единицах рСцог

по шкале прибора

При непосредственном измерении рС^ог прибор ежедневно настраивают в режиме "рХ" по растворам сравнения с рСтг равным 2 и 4, используя соответствующие ручки прибора.

Температура анализируемых растворов и растворов сравнения должна быть одинаковой. Настройку прибора проверяют по растворам сравнения не менее 3 раз в течение рабочего дня, используя каждый раз свежие порции растворов. Измерение концентрации иона нитрата в милливольтах.

При измерении в милливольтах тумблер "Род работы" ставят в положение "мВ" и проводят измерение ЭДС в растворах сравнения, начиная с низшей концентрации.

Электрод имеет линейную функцию в диапазоне от 1,0 до 4,0 ед. рСью- с наклоном (56 ± 3) мВ на ед. рСцог- Если характеристика электрода отличается от заданной, электрод не пригоден для работы.

Величину рСцогу в анализируемых пробах находят по градуировочному графику, построенному по результатам измерения ЭДС в растворах сравнения с pCNOl- равным 1,2,3, и 4. Обработка результатов.

Массовую долю нитратов в мг/кг продукции находят по величине с pCNOi~ помощью вспомогательных таблиц (стр. 77-79): для анализа сухого материала, для анализа материала, содержащего 80- 90% воды: огурцы, томаты, арбузы, дыни, капуста, лук на перо; и для анализа материала, содержащего 70-80% воды: картофель, морковь, столовая свекла, лук-репка. Приготовление реактивов. 1%-ный раствор алюмокалиевых квасцов (экстрагиру-ющий раствор). 10.0 г алюмокалиевых квасцов взвешивают с точностью до ± 0.01, помещают в колбу на 1 л, растворяют и доводят до метки дистиллированной водой. Раствор можно хранить в банке с притертой пробкой не более 1 года. Прн появлении осадка или мути раствор заменяют новым.

Раствор с концентрацией C/NOf/^O.Ol моль/лтр {рСког= 2) готовят десятикратным разбавлением основного раствора (1).

Раствор с концентрацией CWO}7=0.001 моль/литр (pCNOr~3) готовят десятикратным разбавлением раствора (2).

Раствор с концентрацией СШО{1~0.0001 моль/лнтр (дСЛа,-=4) готовят десятикратным разбавлением раствора (3).

Полученные растворы используют для градуировки иономера, проверки электродов и построения градуировочного графика. Подготовка мембранного ионселективного нитратного электрода и вспомогательного электрода к работе

Мембранный электрод ЭМ-NO3 -01. Внутреннюю полость электрода дважды промыть дистиллированной водой, затем дважды промыть приэлектродным раствором с концентрацией 0.1 моль/литр и 0.005 моль/литр КС1. Снять чехол и установить мембрану, предварительно залив в корпус 1.5 мл свежеприготовленного раствора 0.1 моль/л KN03. Вымочить мембрану в корпусе электрода в течении суток в растворе с концентрацией 0.1 моль/л KNO}. В перерывах между работой нитратный электрод хранить в растворе KN03 с концентрацией 0.1 моль/литр.

Вспомогательный электрод.

» Залить внутрь электрода насыщенный при 20° С раствор KCI и выдержать его в этом растворе в течении суток.

4.14. Определение содержания нитратов с помощью нитратомера НМ-002.

Нитратомер НМ-002 предназначен для экспресс-анализа азота нитратов в водных растворах проб почвы, воды и растительной продукции методом прямой потенциометр ии с помощью электродной системы, включающей иоиселективный и вспомогательный электроды.

Подготовка к анализу материалов, реактивов и электродов та же,что и при определении нитратов описанным выше методом.

Нитратомер может работать в режиме измерения концентрации азота нитратов от 1.5 до 1999 мг/кг, а также в режиме определения абсолютного значения ЭДС от 0 до 1000 мВ, либо приращения ЭДС электродной системы от -199 до +199 мВ.

Измерительный преобразователь нитратомера НМ-002 преобразует ЭДС электродной системы в измеряемой пробе в значение концентрации азота нитратов в соответствии со статистической функцией:

где:              С - концентрация азота, мг/кг; К - коэффициент

пропорциональности, устанавливаемый методикой подготовки пробы и учитываемый прн калибровке прибора, К = 1.0-15 мг/кг; Ei - ЭДС электродной системы в калибровочном растворе, соответствующем известной концентрации азота нитратов СьS -

крутизна характеристики электродной системы,                             мВ/ при

20°С; Е| - характеристика электродной системы,где: Е0

- ЭДС электродной системы при рСтг = 0 - величина, зависящая от данного измерительного и вспомогательного электродов, Е0 = (0 ±1000) мВ.

При анализе почвы, пересчет величины pCNor в массовую долю азота нитратов используют К - 3.5 мг/кг (по ГОСТу).

При анализе растений устанавливается пересчетный коэффициент К=3.6 мг/кг при анализе продукции с содержанием воды 70-80 %, К=3.бб мг/кг при анализе продукции с содержанием воды 80- 90%. Для расчета концентрации нитратов в пробе растений, результат измерения следует умножить на 10.

4.14.1. Калибровка прибора.

Калибровку прибора начинают с раствора с наименьшей концентрацией pCNa,~ = 4.

Промытые дистиллированной водой и протертые фильтровальной бумагой электроды поместить в раствор с pCWOj-=4. Через 1-2 мин. при нажатой кнопке "gt;0lt;" установить на жидкокристаллическом индикаторе (ЖКИ) "0,00 мВ", отжать кнопку "gt;0lt;".

Регулировкой "К)” установить на ЖКИ "03.6" при анализе растительной пробы или " 03.5" при анализе почвы.

Вынуть электроды из раствора, промыть дистиллированной водой, протереть и поместить в раствор с tНажать кнопку

"gt;0lt;".

Через 1-2 мин. записать приращение ЭДС электродной системы в растворе с pCNagt;- = 2. Отжать кнопку "З'Ос".

Регулировкой "Кг" установить на ЖКИ 360 или 366 гфи анализе растительной пробы, в зависимости от характера исследуемого материала, или 350 - при анализе почвы. Вынуть электроды из раствора, поместить в дистиллированную воду, объемом ие менее 50 мл и промыть в ней до показаний иономера менее "01.0".

При необходимости сменить воду и повторить промывку. Электроды протереть и поместить в раствор с рСцо,-= 3. Нажать кнопку "gt;0lt;".

Через 1.5-2 мин. записать приращение ЭДС системы в растворе с рСцог = 3. Нажать кнопку иgt;0lt;и. Записать показания мономера.

В контрольном растворе с pCNor ~ 3 после калибровки прибора на ЖКИ должно высветиться "36.0 ± 4.2" или "36.6 ± 4.2" при анализе растений, или 35.0+4.2 при анализе почвы.

Приращение ЭДС при переходе от раствора с pCNOl- = 4 к раствору с pCNOl- = 3 или от раствора с pCNCh- - 3 к раствору с рСцог - 2 должно составлять не менее 53 мВ при 25°С.

После калибровки прибора электроды ополаскивают в дистиллированной воде и промокают фильтровальной бумагой. Затем проводят определение в исследуемых растворах.

При перерывах в работе более 1 часа электроды хранят в 0001 н. растворе KNO%.

4.15. Определение углеводов, содержание в растениях,

классификация.

Углеводы являются основным продуктом фотосинтеза, на их основе в процессе обмена веществ в растительном организме формируются белки, жиры, нуклеиновые кислоты и другие соединения. Углеводы - основной источник для аэробного и анаэробного дыхания клеток; источник энергии для возобновления вегетации. Обычно растение содержит большой набор разнообразных углеводов. В процессе вегетации соотношение растворимых и нерастворимых форм изменяется. В молодых растениях преобладают моно- и дисахариды, в период созревания увеличивается содержание крахмала, целлюлозы, т.е. нерастворимых форм.

Содержание углеводов и их разнообразие определяются видом растения, фазой развития и абиотическими факторами среды и изменяются в широких пределах. Например, зерно пшеницы содержит 3 % растворимых углеводов и 70 % крахмала, в свекле - 20 % растворимых углеводов (сахарозы), в картофеле - 20 % крахмала, а волокно хлопчатника на 90 % состоит из целлюлозы.

Определение углеводов в растительной продукции позволяет: а) установить закономерности обмена этих веществ при формировании урожая, при созревании и хранении продукции; б) оценить качество плодов, овощей, зеленой массы и возможность их технической

переработки, например, у сахарной свеклы, картофеля и др.; в) в здравоохранении составить энергетический баланс, в зоотехнике рассчитать пищевой рацион.

Принята следующая классификация углеводов:

Моносахариды состоят из одной молекулы углевода, хорошо растворимы в воде.

Полисахариды 1-го порядка состоят из двух, а раффиноза из трех молекул моносахаридов, соединенных между собой " кислородным мостиком" (связь -О-), хорошо растворимы в воде.

Полисахариды 2-го порядка состоят из нескольких тысяч молекул моносахаридов, в основном глюкозы, соединенных между собой кислородными мостиками. Упаковка молекул осуществляется в виде циклических цепей, например инулин, в виде ветвистой структуры - крахмал, мицелляпьных нитей - клетчатка. Клетчатка нерастворима в воде, крахмал дает коллоидные растворы. Эти углеводы обеспечивают механическую прочность клеточных стенок и многих органов растений, формируют покровные ткани, обеспечивают стабильность биохимического состава при обмене веществ в растениях и хранении продукции.

Существуют количественные методы определения моносахаридов:              химические, поляриметрические. Определение

полисахаридов в растениях осуществляется теми же методами, но , прежде кислородная связь (-О-) этих соединений разрушается в процессе кислотного гидролиза, а в почве этот процесс идет медленно , за счет гидролитических ферментов почвы или почвенной биоты.

Принцип метода. Растворимые углеводы извлекаются из растительного материала горячей дистиллированной водой. В одной части фильтрата определяют моносахариды, в другой - после гидролиза соляной кислотой - ди- и трисахариды, которые распадаются при этом до глюкозы. Полученная в растворе смесь простых углеводов называется "инвертированным сахаром".

Метод определения основан на способности моносахаридов, содержащих альдегидную или кетонную группу восстанавливать феллннгову жидкость. Последняя представляет собой смесь 1:1 щелочного раствора сегнетовой соли (калий, натрий виннокислый) н сернокислой меди. При этом моносахариды окисляются до соответствующих кислот, а окись меди восстанавливается до закиси меди, которая выпадает в осадок красно-бурого цвета. Количество осадка эквивалентно количеству углеводов.

Полисахариды не имеют альдегидных или кетонных группировок, поэтому их количественное определение возможно только после кислотного гидролиза до моносахаридов. Сахароза после гидролиза образует молекулу глюкозы и фруктозы, а крахмал распадается на несколько сотен молекул глюкозы.

При смешивании раствора сернокислой меди и щелочного раствора сегнетовой соли идут реакции:

Таким образом получают комплексное соединение окиси меди, которая находится в растворе. Если в этот раствор добавить испытуемый раствор моносахаридов, окись меди восстанав-ливается до закиси меди, которая выпадает в осадок красно-бурого цвета.

Осадок закисной меди учитывается объемным методом. На асбестовом фильтре в трубке Аллена осадок растворяют сернокислым раствором железоаммиачных квасцов.

СщО + 2FeJSOdj + Н?04 = 2 CuS04 + 2Fe S04 + НгО

Железо из трехвалентного переходит в двухвалентное, которое затем оттитровывается раствором КМп04, точно известной нормальности.

Количество перманганата эквивалентно количеству меди, которая выпала в осадок. Рассчитывают осадок меди в мг, а затем по специальным таблицам Бертрана находят соответствующее количество глюкозы в мг. Ход анализа. На аналитических весах берут навеску воздушно-сухого растительного материала 1 г ± 0.001 в химический стакан на 150 -200 мл. Приливают цилиндром 125 мл горячей дистил иров а иной воды и ставят на водяную баню, предварительно нагретую до

80° С. Одновременно ставят контрольный стакан с водой, в него погружают термометр. Экстрагируют углеводы в течении 30 мин. при температуре 75-80° С, периодически перемешивая стеклянной палочкой с резиновым наконечником. Палочка всегда находится в стакане. Охлаждают суспензию до комнатной температуры и осаждают белки. Для этого в надосадочную жидкость по каплям приливают раствор уксуснокислого свинца. Каждую каплю энергично размешивают. На осаждение белков расходуется около 0,5 мл осадителя в зависимости от качества анализируемого материала. Учитывают общее количество осадителя в каплях или в мл. Нельзя допустить недостаток или избыток свинца. Полное осаждение или созревание осадка белка проходит в течение 4 часов, лучше осадок оставить на ночь. Возможный избыток уксуснокислого свинца осадить 10%- ным раствором NajSOu прибавив его в тройном количестве по отношению к израсходованному раствору свинца. Тщательно перемешать суспензию в стакане. Оставить для созревания осадка. Отфильтровать суспензию через бумажный складчатый рыхлый фильтр и стеклянную воронку диаметром 8-10 см в мерную колбу на 200 мл. Осадок полностью перенести на фильтр, промыть содержимое стакана и осадок на фильтре малыми порциями горячей дистиллированной воды. Охладить раствор, перемешать, довести до

метки и снова тщательно перемешать. Фильтрат прозрачный, окраска от слабо-желтой до соломенно-желтой за счет растительных пигментов.

7. Для следующих определений используются объемы:

4.16.2. Определение моносахаридов. В коническую колбу Эрленмейера на 100 мл с узким горлом внести пипеткой 20 мл раствора CuS04, добавить 20 мл раствора сегнетовой соли, хорошо перемешать. Добавить в колбу 20 мл испытуемого раствора углеводов, перемешать. Последовательность внесения растворов и их соотношение не менять! Поставить на горелку с асбестовой сеткой или электроплитку, нагреть смесь, кипятить при слабом кипении 3 мин. по песочным часам. На дне колбы образуется красно-бурый осадок закиси меди. Отфильтровать раствор в горячем состоянии через асбестовый фильтр, помещенный в трубку Аллена, в большую колбу Бунзена с помощью водоструйного или вакуумного насоса. Промыть осадок закисной меди 7-8 раз малыми порциями горячей дистиллированной воды и количественно перенести его на фильтр. Осадок на фильтре должен быть покрыт водой, на воздухе не оставлять! Осадок, промытый, с трубкой Аллена перенести на малую, приблизительно 250 мл, чистую колбу Бунзена. Растворить осадок в трубке при выключенном иасосе железоаммиачными квасцами (около 10-15 мл), приливая их в коническую колбу, так как там могут быть следы закиси меди, а затем вылить в трубку. Осторожно растворить осадок с помощью малой стеклянной палочки. Содержимое трубки промыть 5-6 раз малыми порциями горячей воды при включенном насосе. Раствор и промывные воды в малой колбе Бунзена не охлаждая, осторожно, при слабом перемешивании оттитровать раствором перманганата 0.02 или 0.05 и. до слабо-розовой окраски.

4.16.3. Расчет.

1мл0.1н.соответствует 6,36 мг Си.

а млсоответствует X мг Си

где: а - объем перманганата (мл), пошедшего на титрование; X - количество меди в осадке (мг).

По таблицам Бертрана находим:

X мг Си соответствует А мг глюкозы, а далее:

содержание моносахаров

где: А - мг глюкозы по таблицам Бертрана (стр. 107-109); Р - разведение 200/20; Н - навеска воздушно-сухого вещества, г; 1000 - пересчет мг в г. Определение суммы сахаров растворимых углеводов Взять 50 мл фильтрата в мерную колбу на 100 мл, прилить цилиндром 5 мл конц. НС1 и поставить на водяную баню, предварительно нагретую до 80°С. В контрольную колбу налить 50 мл воды и 5 мл кислоты, опустить термометр, поставить в баню. Гидролиз сахаров проводят в бане при постоянном помешивании при температуре 68-70° С в течении 5 мин. по песочным часам. Охладить раствор, добавить 2-3 капли фенолфталеина, далее нейтрализовать его малыми порциями сухой соды, используя объем « 100 мг на кончике скальпеля (до слабо розовой окраски). Каждую порцию соды тщательно перемешивают круговым движением колбы не отрывая ее донышко от стола. Не допускать бурного вспенивания раствора. Довести раствор до метки водой, тщательно перемешать. Использовать раствор для определения суммы сахаров. Так как в растворе после гидролиза находятся только моносахариды, определение ведем по той прописи, котооая ппиволится выше.

Содержание суммы сахаров              где:

В - мг глюкозы по табл. Бертрана (стр. 107-109); Р - разведение

Далее можно рассчитать содержание непосредственно дисахаридов:

% дисахаридов = (% суммы сахаров - % моносахаридов) • 0.95

(0.95 - поправочный коэффициент, так как одна молекула сахарозы дает при гидролизе 0.95 молекулы глюкозы).