Методы гибридизации нуклеиновых кислот

Первые сообщения о прикладных исследованиях, в которых использовали гибридизацию нуклеиновых кислот со специфическими ДНК-овым или РНК-овым зондами, появились в середине 70-х гг. XX в. В 80-х гг. был разработан дот-блот анализ, в котором иммобилизованная ДНК гибридизу- ется с меченным зондом. Появление нового метода открыло новые возможности для детекции фитопатогенов.
Согласно этому методу ДНК тестируемого образца сорбируют на нитроцеллюлозной (реже на нейлоновой) мембране. Чтобы разделить цепи двуцепочечной молекулы ДНК, мембрану с иммобилизованной ДНК обрабатывают щелочью или нагревают. Сайты связывания на мембране, оставшиеся свободными, блокируют с помощью ДНК других организмов (например, из спермы лосося) или белком (например, бычьим сывороточным альбумином или сухим обезжиренным молоком). Затем, мембрану при определенных температуре (обычно при 65 °С) и концентрации солей инкубируют в растворе, содержащим зонд. Этот зонд представляет собой небольшие одноцепочечные ДНК или РНК, несущие радиоактивную или нерадиоактивную метку. Если анализируемая ДНК содержит комплементарные последовательности, зонд связывается с ней. Чем больше количество последовательностей, комплементарных зонду присутствует в тестируемой

ДНК, тем выше степень связывания зонда. Не связавшиеся молекулы зонда 81 удаляются отмыванием.
Результаты гибридизации могут быть обнаружены различными способами, которые определяются типом метки, ковалентно связанной с зондом (так называемой молекулы-репортера). Сначала в качестве метки использовали изотоп фосфора (Р32), а результаты обнаруживали методом авторадиографии по затемнению рентгеновской пленки. Радиоактивность метки была причиной весьма ограниченного применения метода гибридизации в области прикладной диагностики болезней растений. Однако очень быстро на смену введения радиоактивной метки пришла методика биотинилирования зонда. После гибридизации с таким зондом мембрана контактирует сначала со стрептовидином (или авидином), конъюгированным с пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой, а затем — субстратом. В месте положительной пробы образуется окрашенный продукт ферментативной реакции. Кроме этого, применяют хемилюминесцентные или флуоресцентные зонды, свечение которых фиксируют на рентгеновской пленке. О зондах, меченых флуорогенными молекулами, будет сказано ниже (см. «Методы с использованием ПЦР»).
Процесс проведения гибридизационного анализа, особенно в том случае, когда зонд несет ферментную метку, очень похож на процедуру дот- ELISA, но следует отметить, что два этих метода основаны на принципиально различном взаимодействии. В ELISA антигены связываются молекулами специфичных к ним антител, в то время как гибридизация является результатом отжига комплементарных цепей нуклеиновых кислот.
Последовательности, используемые в качестве зондов, могут быть получены из нуклеиновых кислот организмов и вирусов или синтезированы химически. Синтетические зонды — это короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, обычно содержащие 20—40 оснований. Синтетические олигонуклеотиды, особенно в комбинации с ПЦР, занимают важное место в диагностике фитопатогенов, так как с их помощью разрабатывают расо- и шамм-специфические тесты для детекции дифференциации близкородственных рас или штаммов, а также относительно менее специфичные тесты, позволяющие определить принадлежность патогена к определенному таксону. Возможности точной видовой и внутривидовой идентификации возбудителей, а следовательно и надежность определения заболевания с помощью олигонуклеотидных зондов, возрастают по мере того, как увеличивается число секвенированных геномов фитопатогенных микроорганизмов и вирусов. Однако, диагностика, основанная на гибридизации нуклеиновых кислот с зондами, имеет ряд ограничений в отношении чувствительности, кроме того, она требует довольно много времени и усилий. Ее чувствительность сравнима с ELISA. Для ее проведения необходимо располагать достаточным количеством ДНК, т. е. нужно, чтобы образец содержал довольно много пропагул патогена (например, по крайней мере 10 000 бактериальных клеток). Процесс гибридизации невозможно полностью автоматизировать.


Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) был предложении в 1983 г. Кэри Мюллисом. Первое сообщение о практическом применении метода появилось в 1985, после чего количество подобных сообщений стало нарастать поистине лавинообразно. В настоящее время опубликовано огромное количество работ, где ПЦР применяют как метод фундаментальных и прикладных исследований для различных целей в самых разных сферах биологической науки. Хотя для диагностики микроорганизмов ПЦР в первую очередь была использована в медицинской микробиологии, она очень быстро заняла лидирующее место среди других методов детекции и идентификации фитопатогенов. Ведущее место, которое метод ПЦР занимает в решении диагностических задач, обусловлено тем, что он позволяет обнаруживать и многократно воспроизводить (амплифицировать) in vitro определенные последовательности ДНК, присутствующие в следовых количествах среди огромного числа других полинуклеотидов. Это обеспечивает чрезвычайно высокий уровень чувствительности при обнаружении и идентификации целевого фитопатогена в составе сложных биологических матриц или объектов окружающей среды.
Метод ПЦР основан на происходящем в природе процессе репликации ДНК, включающей в себя раскручивание двойной спирали ДНК, разделение ее цепей, и комплементарное достраивание каждой из них ферментом ДНК-зависимой ДНК-полимеразой. Механизм ПЦР хорошо изучен и подробно описан. При проведении реакции в тест-пробирке образец ДНК, в присутствии коротких олигонуклеотидов, называемых праймерами, подвергают воздействию определенной температуры, при которой происходит плавление двойной спирали. Праймеры служат в качестве «затравки» для синтеза выбранного фрагмента ДНК. Они комплементарны последовательностям 5- и 3-концов фрагмента (прямой и обратный праймеры) и ориентированы таким образом, чтобы обеспечить достраивание новой ДНК цепи. После связывания праймеров с комплементарными последовательностями нуклеотидов (отжига), фермент Taq-полимераза наращивает вторую цепь специфического фрагмента ДНК. Taq-полимераза представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из термофильной бактерии Thermus aquaticus, с оптимумом ферментативной активности при 70-72°С. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых и новых цепей в каждом следующем цикле амплификации, т. е. происходит цепная реакция. Число копий возрастает в геометрической прогрессии, и после 25 циклов амплификации (от 30 секунд до нескольких минут каждый) образуется около 100 копий фрагмента. В автоматическом термоциклере в течение 2-3 часов происходит множество циклов, генерирующих более миллиона копий определяемого фрагмента ДНК. Это приводит к образованию такого количества ДНК, которое достаточно для визуальной регистрации результатов ПЦР с помощью электрофореза.

В ПЦР-анализе могут быть выделены три основные стадии: приготов- 83 ление образца (пробоподготовка), собственно ПЦР и детекция продукта реакции (амплифицированного фрагмента ДНК). Реакционная смесь состоит из следующих основных компонентов: (1) ДНК с фрагментом, который необходимо амплифицировать; (2) пара праймеров; (3) Taq-полимераза; и (4) четыре типа дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP) для построения комплементарной цепи в амплифицируемом сайте.

Кроме того, в реакционной среде должны присутствовать ионы Mg2^.
Детекция синтезированного продукта полимеразной реакции (ампли- кона) может быть проведена различными способами. Один из типичных способов — электрофоретическое разделение в агарозном или полиакриламидном геле с последующей визуализацией ампликона интеркалирующими флуоресцентными красителями, такими как бромистый этидий. Наряду с бромистым этидием, ПЦР продукты в геле могут быть окрашены серебром. Иногда необходимо разделение в полиакриламидном геле. Перед электрофорезом амплифицированная ДНК может быть обработана эндонуклеазами рестрикции для изучения полиморфизма длины фрагментов рестрикции амплифицированного продукта. Также применяется детекция амплифицированного фрагмента ДНК посредством гибридизации с зондами, несущими различные метки. К примеру, возможно измерение флуоресценции олиго- нуклеотидного зонда (прямо или косвенно) после гибридизации его с продуктами реакции в жидкой фазе, или на специальной подложке (см. «ПЦР в формате FLASH» и «Метод микроэррай-анализа»).
Методы детекции с использованием микротитровальных плашек, где продукты ПЦР выявляются методом ELISA, также часты в применении.
Существуют и другие методы анализа продукта амплификации. Они включают высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), ка- пиплярный электрофорез, и масс-спектрометрию. Внедрению данных подходов могла бы способствовать автоматизация считывания результатов. Следует особо подчеркнуть, что подобные техники сейчас используются в биочипах для детекции продуктов амплификации.
Говоря о ПЦР и техниках гибридизации, следует упомянуть принципиально новое направление в развитии систем регистрации: оптические биосенсоры. Диагностика патогенов посредством данных устройств не требует модификации ПЦР-продуктов или введения зондов. Биосенсоры позволяют определять в режиме реального времени пикограммы фрагментов нуклеиновых кислот, иммобилизованных на поверхности оптической ячейки. Конструкция ячейки в идеале дает возможность проводить ее регенерацию после каждого цикла определения и многократно использовать одну и ту же ячейку. Применение оптических биосенсоров может быть весьма перспективным для количественной детекции фитопатогенов.
В современной фитопатологии ПЦР применяют не только для диагностики патогенов растений, но также в таксономии и филогении вирои-

84              Таблица 3.2
Некоторое экономически важные болезни, для идентификации возбудителей
которых доступны коммерческие диагносткумы на основе ПЦР

С/х культура	Заболевание	Возбудитель
Злаковые
	септориоз колоса и листьев	Stagonospora nodorum
Пшеница	септориоз листьев	Septoria tritici
	бурая ржавчина	Puccinia recondita
	фузариозная корневая гниль	Fusarium culmorum
Кукуруза	бактериальное увядание	Pantoea stewartii subsp. stewartii
Картофель и овощи
	фитофтороз	Phytophthora infestans
	бурая бактериальная гниль	Ralstonia solanacearum
	кольцевая бактериальная гниль	Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
		вирус скручивания листьев (PLV)
Картофель		Х-вирус
	болезни вирусной этиологии	Y-в и рус
		М-вирус
		S-вирус
		А-вирус
		вирус метельчатости клубней (PMTV)
	веретеновидность клубней	вироид веретеновидности клубней (PSTV)
	аскохитоз	Didymella lycopersici
	бактериальный рак	Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis
Томат	водянистая гниль плодов	Erwinia carotovora subsp. carotovora
	некроз сердцевины стебля	Pseudomonas corrugata
	черная бактериальная пятнистость	Xanthomonas euvesicatoria
	аскохитоз	Phoma cucurbitacearum
Огурец		Didymella bryoniae
	угловатая пятнистость листьев	Pseudomonas syringae pv. lacrimans
Плодовые
Яблоня, груша, айва и др. растения сем. ро	бактериальный ожог плодовых	Erwinia amylovra
зоцветных
Технические культуры
Сахарная векла	ризомания	вирус некротического пожелтения жилок (BNYVV)
Хлопчатник	фузариоз	Fusarium merismoides
		F. oxysporum
Другие культуры
Банан	Черная штриховатость листьев (Black Sigatoka)	Mycosphaerella fijiensis

Глава 3. Современные методы диагностики фитопатогенов



дов, вирусов, фитоплазм, бактерий, грибов, оомицетов и нематод. Эта тех- 85 ника широко используется для мониторинга болезней растений, а также для детекции возбудителей болезней в органах вегетирующих растений, семенах, фруктах и другой хранящейся продукции растениеводства. Она была применена для обнаружения вирусов многих экономически важных сельскохозяйственных культур и других культивируемых растений. Перечень видов, рас и изолятов оомицетов и грибов также включает представителей наиболее вредоносных таксонов (например, Phytophthora, Pythium, Aspergillus, Colletotrichum, Fusarium, Gaeumannomyces, Helmintosporium, Mycosphaerella, Phoma, Puccinia, Rhizoctonia, Sep toria, Tilletia, Us til ago, Verticillium). Протоколы ПЦР были разработаны для многих важных фитопатогенных бактерий, и ряд праймеров, подходящих для их идентификации, приведен в соответствующих руководствах по идентификации фитопатогенных бактерий. Список некоторых экономически значимых болезней сельскохозяйственных растений, ПЦР-диагностика возбудителей которых уже получила практическое использование в сельском хозяйстве, приведен в табл. 3.2. Метод ПЦР применяется также для обнаружения фитопатогенных нематод, в частности с целью контроля золотистой и бледной картофельных нематод, являющихся карантинными объектами.

Еще по теме Методы гибридизации нуклеиновых кислот:

1. Взаимодействие токсикантов с нуклеиновыми кислотами. 
2. Установление генетической роли нуклеиновых кислот
3. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ НУКЛЕИНОВОГО ОБМЕНА В ЯВЛЕНИЯХ ПОКОЯ ЗАПАСАЮЩИХ ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ II МЕТОДОВ ЕГО РЕГУЛИРОВАНИЯ
4.   Турбидиметрический метод с сульфасалициловой кислотой.  
5.   Определение пировиноградной кислоты по модифицированному методу Фреедмана и Хаугена. 
6. Опыты по гибридизации растений. Накопление сведениЗ о наследуемых признаках
7. С.Я.Краевой. ВОЗМОЖНА ЛИ ВЕГЕТАТИВНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ РАСТЕНИЙ ПОСРЕДСТВОМ ПРИВИВОК?, 1967
8. Свойства гуминовых кислот
9. Производные хлорфеноксиуксусной и хлорфеноксипропионовой кислот
10.   Никотиновая кислота (витамин В5).  
11. ОТРАВЛЕНИЕ СИНИЛЬНОЙ КИСЛОТОЙ
12. Производные карбаминовой, тио- и дитиокарбаминовой кислот
13.   Определение мочевой кислоты в сыворотке крови по реакции с фосфорно-вольфрамовым реактивом. 
14.   Определение молочной кислоты по реакции с параоксидифени- лом. 
15. СЛОЖНЫЕ УДОБРЕНИЯ НА ОСНОВЕ ФОСФОРНОЙ И АЗОТНОЙ КИСЛОТ И АММИАКА
16.   ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛЕТУЧИХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ  
17.   Определение сиаловых кислот в сыворотке крови по реакции с резорцином.