Методы диагностики, основанные на анализе нуклеиновых кислот фитопатогенов

Интенсивное развитие молекулярной биологии в 80-90 гг. двадцатого столетия привело к разработке специфичных, чувствительных и быстрых методов диагностики возбудителей болезней растений. Пожалуй, самая существенная особенность молекулярно-биологических методов детекции и идентификации фито патогенов, которая дает им преимущество над им- мунохимической диагностикой, состоит в том, что анализу повергается генетическая информация, отражающая наиболее консервативные свойства патогена (Завриев, 2009).

Как следует из предыдущего раздела, в настоящее время в распоря- 79 жении исследователей имеется целый ряд иммунохимических методов, обеспечивающих быструю и надежную диагностику. Однако, ограничения методов, использующих взаимодействие антигенов с антителами, возрастают по мере того, как усложняется структура и становятся разнообразнее свойства анализируемого фитопатогена. Например, идентификации возбудителей бактериальных, и особенно грибных, болезней методами иммунодиагностики представляет определенную проблему. Антигенный спектр грибов и бактерий более сложен, чем у вирусов и зависит от стадии онтогенеза. Антигены, присутствующие на одной стадии, могут изменяться по мере развития микроорганизма или вообще отсутствовать на другой стадии. Кроме того, довольно часто бывает трудно получить антитела с такой степенью специфичности, которая требуется для того, чтобы дифференцировать расы, патотипы или близкородственные виды.
Что касается .диагностики вирусов, то здесь исследователь иногда сталкивается с проблемой низкой иммуногенности, обусловленной специфической пространственной структурой белка оболочки вирусов. К тому же даже с помощью моноклональных антител не всегда удается обнаружить различия между близкородственными штаммами некоторых вирусов. Наконец, весьма непростая задача — получение антител против вироидов, представляющих собой молекулы РНК и, соответственно, не имеющих в своем составе белков.
Применение в диагностических целях молекулярно-биологических технологий позволяет преодолевать как указанные, так и некоторые другие недостатки иммунохимического метода. В частности, недостаточную специфичность (которая проявляется в виде перекрестных реакций и приводит к ложно-положительным результатам) и недостаточную чувствительность (которая может иметь место, если концентрация патогена очень низка, как бывает, например, в случае латентной семенной инфекции). Важно, что для достоверного анализа ДНК и РНК достаточно всего несколько микролитров образца.

Кроме того, некоторые методы одновременно с обнаружением фитопатогенов позволяют проводить их быструю идентификацию.
Молекулярно-биологические методы находят свое применение в самых разных областях фитопатологии, например, для генетической характеристики видов, специализированных форм, рас, патопитов, штаммов или изолятов; для изучения структуры популяций патогенных видов; при исследовании устойчивости растений к болезням — для идентификации генов устойчивости в растениях (R-генов), и генов, кодирующих у патогенов эффекторы, преодолевающие R-гены; при изучении ранних стадий взаимодействия паразитов и вредителей с растениями-хозяевами и процессов ток- сигенеза и т. д. В течение последних десяти лет число исследований, выполненных с привлечением этих методов, стремительно растет. Многие фундаментальные результаты, которые обсуждаются в последующих главах этой книги получены благодаря их применению.

              В данном разделе будут рассмотрены те методы диагностики на осно
ве анализа нуклеиновых кислот, которые сейчас наиболее часто используются для детекции и идентификации фитопатогенов. Они могут быть разделены на две группы. Первая — это методы гибридизации нуклеиновых кислот с молекулярными зондами, которые представляют собой относительно короткие последовательности ДНК или РНК. Вторая включает методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР), амплифицирую- щей фрагменты нуклеиновых кислот. Методики с применением гибридизации появились раньше метода полимеразной цепной реакции и до середины 90-х гг. широко использовались альтернативно последнему. Сегодня эти методы используются совместно, дополняя друг друга, и в ряде случаев объединение с гибридизационной техникой усиливает диагностический потенциал ПЦР. При этом, выбор той или иной версии из каждой группы методов зависит оттого, является ли целевая нуклеотидная последовательность известной или же частично или полностью неизвестной. Методы ПЦР и гибридизация нуклеиновых кислот всесторонне описаны во множестве публикаций, число которых быстро растет, в том числе в учебниках по молекулярной биологии, где подробно объясняются их теоретические основы. Поэтому в этом разделе изложены лишь наиболее общие аспекты применения указанных методов в диагностических целях. Конкретные примеры их использования даны для наиболее важных представителей различных фитопатогенов. Ссылки на оригинальные статьи можно найти в обзорах, список которых дан в конце главы. 

Еще по теме Методы диагностики, основанные на анализе нуклеиновых кислот фитопатогенов:

1. Взаимодействие токсикантов с нуклеиновыми кислотами. 
2. Установление генетической роли нуклеиновых кислот
3.   ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛЕТУЧИХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ  
4. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ НУКЛЕИНОВОГО ОБМЕНА В ЯВЛЕНИЯХ ПОКОЯ ЗАПАСАЮЩИХ ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ II МЕТОДОВ ЕГО РЕГУЛИРОВАНИЯ
5.   Турбидиметрический метод с сульфасалициловой кислотой.  
6.   Определение пировиноградной кислоты по модифицированному методу Фреедмана и Хаугена. 
7. ЗНАЧЕНИЕ НОВЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ
8.   МЕТОДЫ ОБЩЕГО КЛИНИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КРОВИ  
9. ГЕЛЬМИНТОЛАРВОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
10.   ГЛАВА 4 МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОГО АНАЛИЗА