Обнаружение и учет численности микроорганизмов в почвахметодом посева на плотные питательные среды

Метод посева — один из наиболее распространенных в практике исследования численности, группового и в некоторых случаях видового- состава микроорганизмов в почве. На чашках получают отдельные колонии микроорганизмов, число которых можно подсчитать, из них можно выделять микроорганизмы в чистые культуры для дальнейшего исследования и идентификации.

Образцы почв отбирают в стерильные пергаментные пакеты. С пробной площади можно брать три или пять образцов и анализи- ровать их отдельно, либо составлять средний почвенный образец смешиванием трех-семи индивидуальных проб весом в 100—200 г. Образцы обычно берут по диагонали участка или «конвертом». Микробиологические исследования должны быть сделаны в день взятия образцов, так как при хранении влажных образцов состав микроорганизмов в них очень изменяется. При невозможности проведения анализа в ближайшие сутки прибегают к высушиванию образцов при температуре не выше 30°.

Техника проведения посева из почвы. Перед посевом влажную или сухую хорошо перемешанную почву высыпают на стекло, которое предварительно протирают спиртом, и тщательно перемешивают, освобождая от посторонних включений. Отвешивают 10 г почвы и переносят навеску в колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды. Для разрушения почвенных агрегатов и десорбции клеток микроорганизмов^ применяют различные способы обработки почвенных образцов перед посевом по Звягинцеву: 1) 10-минутное ручное перемешивание почвенной суспензии в колбах; 2) растирание почвы, увлажненной да пастообразного состояния в течение 5 мин в стерильной фарфоровой чашечке резиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке. Увлажнение почвы следует производить водой или диспергирующим раствором. В зависимости от типа почвы и группы исследуемых микроорганизмов целесообразно применять те или иные диспергаторы. Например, для растирания дерново-подзолистой почвы лучше использовать воду; для черноземов и темно-каштановых почв — 0,03— 0,05%-ные растворы акилсульфатов синтетических спиртов; для красноземов — 0,1%-ный раствор пирофосфата натрия; 3) обработка почвенной суспензии на электрической пропеллерной мешалке в течение 5—10 мин; 4) обработка почвенной суспензии ультразвуком на установке УЗДН-1 в течение 3 мин.

Посев почвенной суспензии на плотные среды производят из раз- ведений 1 : 10; 1 ; 100; 1 : 1000 и т. д. в зависимости от численности учитываемых микроорганизмов, типа почвы, ее влажности и т. д. В случае засева плотных сред разведение .подбирают таким образом, чтобы на чашке развивалось 50—200 колоний бактерий и актиномице-

Рис. Э8. Вид чашек Петри с посевом почвенной суспензии на разные среды

тов и 30—50 колоний грибов (рис. 38). При слишком густом или разреженном посеве подсчет количества микроорганизмов будет очень неточным. Из каждого образца почвы берут не менее 3—5 повторных навесок и каждую высевают на 3—5 чашек с различными средами. Для выделения и учета различных групп почвенных микроорганизмов используют специальные среды, состав которых приводится в соответствующих разделах.

Разливку питательной среды лучше производить, когда она имеет температуру около 50°, так как при этом на крышке чашек не образуется капель воды в результате конденсации пара. После застывания агара чашки помещают в сушильный шкаф и подсушивают при температуре 70—80° до появления на поверхности агара муарового рисун ка. Это свидетельствует о том, что пленка воды с поверхности агара удалена и при размножении на ней колонии бактерий не будут расплываться.

На поверхность застывшей и подсушенной среды наносят каплю почвенной суспензии определенного разведения и с помощью стеклянного шпателя распределяют ее по всему агару. Засеянные чашки подписывают, переворачивают вверх дном и помещают в термостат при соответствующей температуре. Сроки учета микроорганизмов зависят от состава питательной среды и группы учитываемых микроорганизмов.

Подсчет количества колоний на чашке проводят обычно со дна чашки в проходящем свете. На месте подсчитанной колонии чернилами по стеклу ставят точки. Для удобства подсчета чашку можно разделить на квадраты или секторы и в них подсчитывать количество колоний. В случае использования непрозрачных сред (например, почвенного агара) подсчет производят с поверхности агара.

Подсчитав количество колоний на всех параллельных чашках, вычисляют среднее их число на одной ташке и затем делают пересчет для определения содержания микроорганизмов в 1 г свежей почвы по1 формуле: а = б-в-г, где а — количество клеток в 1 г свежей почвы, б — среднее количество колоний на чашке, в — разведение, из которого сделан посев, г — количество капель в 1 мл суспензии.