ОБНАРУЖЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В ПРЕВРАЩЕНИЯХ ФОСФОРА, СЕРЫ, ЖЕЛЕЗА И МАРГАНЦА

Для получения культур бактерий, минерализующих фосфороргани- ческие соединения, используют среды, где единственным источником фосфора служат нуклеиновые кислоты или лецитин, например среда

Менкиной (г/л):              (NH4)2S04— 0,5, NaCl — 0,3, KCI — 0,3, MgS04X

X 7H20 — 0,3, FeS04 — следы, MnS04 — следы, мел — 5,0, глюкоза — 10,0.

Бактерии, минерализующие фосфорорганические соединения, распознают на чашках Петри, засеянных почвенной суспензией, по зонам растворения мела образующейся фосфорной кислотой (рис. 66).

Для выделения микроорганизмов, растворяющих труднорастворимые фосфаты кальция, используют среду Пиковской (г/л): Саз(Р04)2— 5,0, глюкоза — 20,0, NaCl — 0,2, MgS04 — 0,1, MnS04 — следы, FeS04 — следы, агар-агар —              20,0. Соль

Саз(Р04)2 можно вносить непосредственно в чашку Петри перед выливанием в нее расплавленной агаризованной среды. Бактерии, разлагающие трехкальциевый фосфат, распознают по зонам растворения фосфата вокруг них.

Наблюдать бактерии, окисляющие серу, можно с помощью следующей методики. Стерильную застывшую агаризованную среду (г/л):

Инкубацию проводят в термостате в течение 1—2 недель. О развитии тионовых бактерий судят по растворению серы, образованию пленки или помутнению среды, падению pH раствора и присутствию в нем сульфатов. Сульфаты обнаруживают при помощи 5%-ного раствора ВаС12 в 2 н. НС1 (выпадение белого осадка).

Для получения накопительной культуры сульфатредуцирующих бактерий применяют среды Таусона или Постгейта, имеющие следующий состав.

Среда Таусона (г/л):              (NH4)2S04 — 4,0, К2НР04 — 0,5, MgS04X

Х7Н20 — 1,0, соль Мора — 0,5, лактат кальция — 5,0. Иногда к среде добавляют дрожжевую воду (1 мл/100 мл среды).

Среда Постгейта (г/л): КН2Р04 — 0,5, МН4С1 — 1,0, CaS04-2H20 — MgS04-7H20 — 2,0, лактат натрия — 3,5, дрожжевой экстракт — FeS04-7H20 — 0,5, тиогликолят натрия—1,0, или аскорбиновая кислота — 1,0.

Восстановители — тиогликолят, аскорбиновую кислоту добавляют для удаления кислорода из среды. Восстановители готовят в отдельных емкостях: растворяют в освобожденной кипячением от кислорода дистиллированной воде и стерилизуют в ампулах, продутых инертным

Рис. 67. Методы выделения сульфатвосстанавливающих бактерий по Л. Д. Штурм

(вверху) и В. И. Дуде

1 — агар, 2 — почвенная или минеральная пластинка, 3 — парафин

газом перед запайкой. Значение pH сред не должно быть ниже 5,5 и выше 9,0. Оптимальное значение pH 7,0—7,5.

После засева сред почвой (лучше брать болотную почву) пробирки со средами закрывают резиновыми или притертыми пробками, не оставляя воздуха (среду наливают под самую пробку). Сверху пробку заливают парафином. Культуры инкубируют в термостате в течение 3-х нед. Развитие сульфатредуцирующих бактерий регистрируют по почернению осадка в пробирках, происходящему вследствие образования сернистого железа.

Для выделения и учета сульфатвосстанавливающих бактерий применяют метод Штурм. Агаризованную среду Таусона наливают в крышку чашки Петри, а затем, после поверхностного посева почвенной суспензии на поверхность среды, к последней плотно прижимают дно чашки; зазор между стенками дна и крышки заливают стерильным парафином (рис. 67). Вместо дна чашки можно использовать круглые стеклянные пластинки. Существует модификация метода, предложенная В. И. Дудой. Агаризованные среды заменяют пластинками стериль

ной почвы или смесью тонкодисперсных минералов: каолинита, бенто- пита, гипса и силикагеля.

На почвенные пластинки наносят каплю почвенной суспензии и распределяют ее ровно по поверхности пластинки с помощью стеклянного шпателя. На пластинку помещают кружок стекла (или дно чашки Петри), который плотно прижимают к почве (либо минеральной пластинке) так, чтобы удалить пузырьки воздуха. Процедура выполняется легче, если пластинка в центре слегка выпуклая. На последнем этапе парафином заливают часть почвы, находящуюся между краем стеклянной пластинки и стенкой чашки (рис. 67). Черные колонии сульфатредудирующих бактерий становятся заметными на 3—4-е сут инкубации. Рост колоний можно наблюдать в течение длительного времени, не нарушая целостности камер. Учет количества колоний производят через 3—4 недели. Более интенсивное развитие бактерий наблюдается при добавлении 0,5 мл дрожжевого экстракта и 0,1 г лактата кальция на 100 г воздушно-сухой почвы.

Для выявления нитчатых железобактерий Leptothrix применяют метод накопительных культур. Почву или ил вносят в сенной отвар, торфяную вытяжку или пептонную воду, куда добавляют источник железа (например, гвозди) или марганца для индикаторных целей.

Для получения накопительной культуры Leptothrix по Виноградскому в высокий стеклянный цилиндр вносят небольшое количество сена, свежеосажденный гидрат окиси железа Fe.(OH)3 и немного ила или почвы в качестве инокулята, затем цилиндр наполняют водопроводной «водой или водой из водоема и оставляют при комнатной температуре. Анаэробное разложение растительных остатков сопровождается выделением углекислого газа и восстановленных продуктов (Н2gt; H2S, СН4), необходимых для. превращения окисного железа в записное. Растворимый FeC03 в верхних слоях воды окисляется железобактериями и через некоторое время на стенках сосуда появляются темно-бурые пятна, состоящие из скоплений железобактерий.

Для выделения и культивирования Leptothrix используют среды с низкой концентрацией органических веществ — 0,1—2 г/л, например,, среду с набором минеральных солей по ван Вейну следующего состава:              КН2Р04— 27 мг, КгНР04 — 40 мг, Na2HP04*2H20 — 0—40 мг,

MgS04-H20 — 75 мг, СаС12*2Н20 — 50 мг, FeCl3-6H20 — 5 мг, глюкоза—100 мг, гидролизат казеина—100 мг (или KN03), MnS04 — 50 мг, МпС03 — 1 г, записное железо аммонийное лимоннокислое — 100 мг.

Для выделения одноклеточных железобактерий Arthrobacter side- rocapsulatus ( — Siderocapsa eusphaera) используют среду Прингсхей- ма в модификации Тилера следующего состава: MnS04*4H20 — 0,002%, дрожжевой экстракт «Дифко» — 0,005%, дистиллированная вода— 1 л, агар «Дифко» — 1%. Вместо MnS04 на дно пробирки с жидкой средой в некоторых случаях вносят стерильно FeS или добавляют лимоннокислое аммонийное железо из расчета 50 мг/л. Агаризованную среду с железом используют, нанося на застывший агар густую суспензию щавелевокислого закисного железа, а сверху — очень тонкий слой среды указанного состава без марганца. Посев почвенной суспензии производят на поверхность агара. На плотной среде образуются мелкие темно-коричневые колонии. При микроскопировании видны кокки и палочки с капсулами.

Количественный учет железобактерий в пробах почвы, ила, воды проводят методом прямого счета на мембранных фильтрах «синпор» с диаметром пор 0,4 мкм. Для выявления окислов железа на клетках микроорганизмов фильтры окрашивают эритрозином или желтой кровяной солью с соляной кислотой.

Для выделения из почвы бактерий, окисляющих марганец, пользуются методом посева из почвенных разведений на поверхность питательных сред. Почвенную суспензию перед посевом обрабатывают на качалке при 180 об/мин в течение 30 мин. Используют следующие питательные среды. Среда Лиске (г/л дистиллированной воды): MnS04— 0,02, выщелоченный агар-агар—20 (в случае плотной среды) или 1 (в случае полужидкой среды).

Среда Тайлера и Маршалла (г/л дистиллированной воды): MnS04 — 0,02, дрожжевой экстракт — 0,05, выщелоченный агар-агар — 20 (в случае плотной среды) или—1 (в случае полужидкой среды). 3-я среда — агаризованная почва (г/л):              образец изучаемой почвы

(верхний горизонт) — 170, агар-агар — 20, водопроводная вода.

Инкубацию посевов производят во влажной камере в течение месяцев при температуре 25° С. Общее количество микроорганизмов, аккухмулирующих марганец и железо, учитывают чаще всего на агаризованной почве, численность Metallogenium и других марганец- окисляющих бактерий — на всех трех средах. Наличие марганца в отложениях Metallogenium устанавливают при помощи реакции с солянокислым бензидином.

Для выявления в почве Metallogenium используют также метод капиллярной микроскопии. Педоскопы заполняют агаризованным органо-минеральным гелем, приготовляемым из смеси фульвокислот. В некоторых случаях используют стекла обрастания по Холодному, покрытые агаризованным органо-минеральным гелем. Срок экспозиции стекол 2 месяца. Наблюдения ведут под микроскопом. Колонии Metallogenium выявляют на гифах грибов. Они имеют вид черных «паучков» в толще агара.