ОБНАРУЖЕНИЕ И УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В КРУГОВОРОТЕ АЗОТА

Аммонификаторы. Для выявления аммонифицирующих бактерий в почве пользуются методом посева из почвенных суспензий на среду МПА. Накопительную культуру аммонификаторов можно получить, засевая комочками почвы пептонную воду или мясо-пептонный бульон в пробирках или колбочках.

Денитрификаторы. Для обнаружения денитрифицирующих организмов в почве используют метод накопительной культуры. Опыт проводят на среде Гильтая.

Готовят два раствора: 1) KN03 — 2,0, аспарагин—1,0 г, дистиллированная вода — 250 мл; 2) натрий лимоннокислый — 2,5 г, КН2Р04 —2 г, СаС12 —0,2 г, MgS04-7H20 — 2 г, FeCl3 — следы, дистиллированная вода — 500 мл. Оба раствора сливают и доводят объем среды до 1000 мл. Устанавливают pH 7 по индикатору бромтимолово- му синему, который добавляют в среду. Цвет среды должен быть зеленый. Среду наливают высоким слоем в пробирки, стерилизуют, затем засевают комочками почвы. Инкубация продолжается 5—7 дней в термостате при 25—30°. Об идущем процессе восстановления нитратов и образовании азота свидетельствуют посинение среды, появление пузырьков газа и пены на поверхности среды. Среда в пробирках мутнеет от развивающихся в ней бактерий. Микроскопированием денитрифицирующие бактерии идентифицировать не удается вследствие их внешнего сходства с другими бактериями.

Нитрификаторы. Для обнаружения тарификаторов в почве пользуются обычно накопительными культурами на элективной среде Виноградского следующего состава (г/л дистиллированной воды): (NH4)2S04 — 22,0, КгНР04—1,0, MgS04 — 0,5, NaCl — 2,0, FeS04— 0,4, CaC03—0,1. Среду разливают тонким слоем в колбы Виноградского, так как процесс осуществляется в аэробных условиях. После стерилизации колбы, засеянные комочками почвы, инкубируют в течение 5—6 дней в термостате при 25—30°. В накопительной культуре клетки нитритных и нитратных бактерий обнаружить с помощью мик- роскопирования трудно, так как они морфологически сходны с другими бактериями. Поэтому о присутствии в исследуемой почве нитрифицирующих бактерий обычно судят по химическим реакциям, свидетельствующим о присутствии в культуре продуктов жизнедеятельности нитрифицирующих бактерий —¦ азотной и азотистой кислот. Присутствие азотной кислоты в культуре определяют с помощью реакции с дифениламином в крепкой серной кислоте: кристаллик дифениламина помещают в фарфоровую чашечку и растворяют в крепкой серной кислоте; на край чашечки помещают каплю жидкости из накопительной культуры и дают ей стечь. О наличии в культуре азотной кислоты свидетельствует синее окрашивание. Присутствие в культуре нитритов обнаруживают по красному окрашиванию с реактивом Грисса (уксуснокислый раствор смеси сульфаниловой кислоты с а-нафтиламином).

Для обнаружения нитрифицирующих бактерий могут быть использованы и плотные питательные среды — пластинки кремнекислого геля.

Готовят их следующим образом. К соляной кислоте с удельным весом 1,1 приливают при помешивании равный объем жидкого калийного или натриевого стекла с удельным весом 1,05—1,06 и слегка подогревают. Начинающий коагулировать золь быстро разливают по чашкам Петри и дают ему застыть. Затем чашки помещают в сосуд, до дна которого проходит каучуковая трубка, соединенная с водопроводом.

На поверхность гелевой пластинки помещают при помощи трафарета комочки почвы (50—100 штук). Для этого почву увлажняют, равномерно растирают и наносят комочки на пластинку иглой или петлей. О развитии нитрифицирующих бактерий судят по зонам растворения мела и появлению нитритов и нитратов вокруг комочков.

Количественный учет аммонификаторов, денитрификаторов и нит- рификаторов в почве проводят обычно с помощью метода предельных разведений. Почвенную суспензию для посева готовят так же, как и при использовании чашечного метода. Посев производят в пробирки, содержащие определенное количество жидкой питательной среды. Для определения аммонификаторов и денитрификаторов посев обычно делают из десятикратных разведений (до 12 и более). Для определения нитрификаторов ограничиваются 2—4-мя первыми разведениями. Из каждого разведения почвенной суспензии обычно засевают 2—5 параллельных пробирок с соответствующей питательной средой. Пипетки во время постановки подобных опытов следует оберегать от заражения микроорганизмами из воздуха. Для каждого разведения рекомендуется брать новую стерильную пипетку. Расчет количества микроорганизмов проводят с помощью таблиц Мак-Креди.

Азотфиксаторы. Для обнаружения азотобактера методом почвенных комочков навеску почвы (60—100 мг) увлажняют водопроводной водой до пастообразного состояния и микробиологической петлей или иглой раскладывают комочки правильными рядами (50 комочков на каждую чашку Петри) на агар Эшби следующего состава (т/л): К2НРО4 —0,2, MgS04.7H20 —0,2, NaCl — 0,2, KH2P04 —0,1, СаС03 — 5,0, маннит (или сахароза) —20,0, агар-агар — 20,0, вода дистиллированная. Используют две чашки Петри на каждый образец почвы.

Для обнаружения в почве азотобактера используется также м е- тод почвенных пластинок. Навеску почвы (40—50 г), обогащенную необходимыми для развития азотобактера веществами (сахарозы 0,5%, К2НРО4 — 0,1%, мела 1% от массы почвы), помещают в фарфоровую чашечку, увлажняют до пастообразного состояния, тщательно перемешивают и переносят в чашку Петри или Коха. Почву равномерным слоем распределяют по дну чашки, предварительно для лучшей аэрации поместив на дно древесный уголь или битое стекло в качестве дренажа. В чашку наклонно вставляют стеклянную трубочку, проходящую через почвенную пластинку и обеспечивающую газообмен. Пластинки инкубируют во влажной камере в течение 4—6 дней. Появление слизистых колоний на поверхности почвенной пластинки, 'свидетельствует о наличии в исследуемой почве азотобактера.

Для обнаружения в почве анаэробных азотфиксирующих бактерий рода Clostridium пользуются методом накопительной культуры в жидкой среде Виноградского следующего состава (г/л дистиллированной воды): глюкоза — 20, К2НРО4 — 0,1, MnS04, NaCl, FeS04 — следы, MgS04-7H20— 0,5, CaC03— 20,0. Среду наливают в пробирки высоким слоем, засевают комочками исследуемой почвы и пастеризуют 10 мин при 80° в целях освобождения от сопутствующих аэробных неспороносных бактерий.

Через 2—3 сут после посева среда мутнеет, из нее начинают выделяться пузырьки газа. Это результат развития анаэробных споровых бактерий, которые в соответствующих элективных условиях проводят маслянокислое брожение. Глюкоза при этом превращается в хмасляную кислоту и углекислый газ, а в пробирках образуется много пены, появляется запах масляной и уксусной кислот. Последняя также является одним из продуктов маслянокислого брожения. Обычно таким методом наблюдают Clostridium pasteurianum. Клетки Clostridium pas- teurianum легко обнаруживаются при микроскопировании осадка.

Обнаружить клубеньковые бактерии в почве довольно трудно вследствие отсутствия элективных сред. Выявляют их в почве при помощи растений. Опыт ставят следующим образом. В небольшие колбочки Эрленмейера разливают невысоким (4 см высоты) слоем питательную среду следующего состава (г/л): К2НРО4—1,0, MgS04* •7Н20              1,0, СаС03 — 0,5, FeS04, H3B03, MnS04 — следы, агар-агар — 0,1. Колбы стерилизуют при 120° 20 мин. После застывания агара на поверхность среды раскладывают предварительно простерилизованные семена клевера. Стерилизацию семян проводят следующим образом: семена для лучшей смачиваемости обрабатывают спиртом, затем промывают стерильной водопроводной водой, стерилизуют 0,1%-ным раствором сулемы (или 1%-ной бромной водой) в течение 3—5 мин, после чего хорошо промывают стерильной водопроводной водой, несколько раз сменяя ее. При проведении всех операций необходимо соблюдать стерильность. Проверку стерильности семян проводят, помещая семена на МПА или бобовый агар. Отсутствие роста микроорганизмов на этих средах свидетельствует о стерильности семян.

Вместе с семенами в колбочки добавляют 1 мл почвенной суспензии (разведение 1:10). Контролем служит колба, куда добавляют 1 мл суспензии почвы, взятой из-под клевера. Сосуды обертывают снаружи плотной бумагой так, чтобы она закрывала агар и семена, предохраняя бактерии от действия света. Растения выращивают в вегетационном домике или в лаборатории при естественном или искусственном освещении.

Для выделения культур клубеньковых бактерий корни бобовых растений с клубеньками тщательно отмывают от почвенных частиц, клубенек отрезают, промывают в стерильной воде, трижды сменяя ее, помещают в раствор сулемы (1 : 1000) в чашке Петри и выдерживают 2—3 мин. Затем переносят клубенек в чашку Петри со стерильной водопроводной водой, промывают в течение 5 мин, выдерживают в спирте 1 мин и последовательно промывают в 3-х чашках со стерильной водой, выдерживая по 10 мин в каждой. После промывания клубенек переносят в стерильную чашку в каплю стерильной воды и раздавливают стерильной стеклянной палочкой. Одну петлю взвеси переносят из капли на поверхность бобового агара в чашках Петри и размазывают шпателем. Этим же шпателем делают посев еще на двух последовательных чашках. Спустя 1—2 сут инкубации в термостате при 28—30° на чашках вырастают слизистые беловатые непрозрачные колонии, иногда похожие на капли стеарина. Бобовый агар готовят из бобового отвара. 50 г бобов (белой фасоли или гороха) заливают 1 л воды, варят до набухания и растрескивания кожуры (но не до разваривания), фильтруют через вату, доводят водопроводной водой до 1 л, добавляют 1% сахара, 0,05 мг 0,1%-ного раствора К2НРО4 и устанавливают pH 7 раствором соды. Для получения плотной среды добавляют 1,5—2% агара. Стерилизуют при 120° 20 мин.