Почвенные грибы

- Методы выделения почвенных грибов. Для выделения грибов из почвы используют специальные среды. Наиболее употребительные из них сусло-агар и некоторые синтетические среды, в состав которых входят глюкоза, сахароза или фруктоза.

Выделение грибов методом посева из почвенной суспензии на плотные среды дает возможность выявить в большей или меньшей степени набор видов микромицетов, содержащихся в той или иной почве. Однако этот метод не дает представления о том, в каком состоянии находятся те или иные виды грибов в почве: в состоянии спор или активно растущего вегетативного мицелия. Для разделения спор и мицелия используют следующие методы. Метод капиллярных педоскопов Перфильева и Габе, позволяющий наблюдать растущий мицелий и спороношения в естественной среде обитания. Флотационный метод, при котором навеску почвы помещают в двухфазную систему (воду и масло), где споры грибов в результате большей гидрофобности всплывают на поверхность.

Определение количества и биомассы грибов в почве. Использование метода разведений почвенной суспензии с высевом на различные питательные среды не дает реального представления об истинной заселенности исследуемой почвы грибами.

Для прямого учета грибов в почве применяют метод Хансена — определения длины мицелия и числа спор с помощью мембранных фильтров. Метод, усовершенствованный Т. Г. Мирчинк и Т. С. Демки- ной, состоит в следующем. Навеску почвы (0,5—2 г) или три параллельные навески по 1 г растирают в ступке резиновым пестиком с небольшим количеством воды в течение 5 мин. Переносят в колбу с 500 мл дистиллированной воды и встряхивают в течение 5 мин. Почвенную взвесь переносят в цилиндр на 500 мл, отбирают пробу в 10 мл, не давая отстояться, всегда с одного и того же уровня и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 2,5 мкм. После высушивания на воздухе мембранный фильтр окрашивают смесью 1%-ного водного раствора дианилового голубого и 5%-ного водного раствора фенола в отношении 1 : 5, подсушивают на воздухе и рассматривают под микроскопом, предварительно осветляя фильтр в капле иммерсионного масла. Для каждого почвенного образца используют два мембранных фильтра, просматривая в каждом по 50 полей зрения. Измеряют длину грибных гиф с помощью окуляра-микрометра. Используют объектив увеличения 40Х. Длину мицелия рассчитывают по формуле

^                             В • х • S • п

50 • Р • V • С ¦ 10~2

где А — общая длина мицелия в 1 г почвы (см), В — суммарная длина гиф в 50 полях зрения в единицах окуляра-микрометра, х — цена деления окуляра-микрометра (мкм), 5 — площадь фильтра (мм2), п — разведение почвенной суспензии, Р — площадь поля зрения (мкм2), V — объем наносимой суспензии, С — навеска почвы (г).

Объем гиф, выраженный в см3, рассчитывают по формуле

V=a-nr2-10~8 см3.

Если диаметр гифы принять в среднем за 5 мкм, тогда

У = а*3,14* (2,5)2-10“3 см3,

а масса мицелия в 1 г почвы будет равна g = a* 19,6* 10"8-1,05 г, где — удельная масса мицелия.

Для установления таксономического положения грибов определяют их культуральные и морфологические признаки, строение репродуктивных органов.

Методы исследования почвенных грибов. Культуральные признаки грибов описывают на плотных питательных средах в чашках Петри. Используют сусло-агар и синтетические среды. За культурой наблюдают в течение нескольких дней или даже двух недель с интервалом 3—4 дня. При описании культуральных признаков грибов отмечают скорость роста колоний (быстро растущие или медленно растущие) г внешний вид колонии, текстуру колонии (бархатистая, пушистая, шерстистая, шероховатая, войлочная), окраску колонии, окраску субстратного и воздушного мицелия, диффузию пигмента в агар, окраску окружающей среды. Отмечают складчатость колонии, наличие эксудата, его цвет, запах культуры.

Для характеристики морфологических признаков культуры грибов сначала просматривают на чашках при малом увеличении микроскопа, а затем готовят микроскопический препарат. Для наблюдения за репродуктивными органами из колонии вырезают блоки с помощью пробочного сверла. После их изъятия на чашках остаются лунки.

Через 1—2 дня лунка зарастает мицелием, который можно наблюдать под микроскопом.

За развитием мицелия и спорогенезом можно наблюдать на агари- зованных стеклах. Стерильной расплавленной средой покрывают предметные стекла, которые помещают в чашку Петри на П-образную стеклянную подставку. Посев гриба производят штрихом по длинной стороне стекла. Штрихи покрывают стерильными покровными стеклами так, чтобы под ними не оставалось пузырьков воздуха и чтобы часть штриха была свободной. Во избежание пересыхания агара в чашку наливают на дно стерильную воду. Через 6—8 дней инкубации при 25° стекла вынимают и, очистив нижнюю сторону от агара, микро- скопируют.

Мицелий со спороношениями удобно рассматривать, приготовив препарат следующим образом. Небольшой кусочек питательной среды помещают на стерильное предметное стекло, инфицируют грибной культурой, покрывают покровным стеклом и инкубируют 2—3 сут. Затем снимают покровное стекло, кладут его на предметное и микро- скопируют.

Для изготовления микроскопического препарата препаровальными иглами вырезают небольшой участок колонии, помещают в каплю воды и закрывают покровным стеклом. К воде добавляют этиловый спирт 1 : 1 или концентрированную уксусную кислоту, поскольку споры грибов не смачиваются водой. Для приготовления микроскопических препаратов грибов используют специальную жидкость:              карболовая

кислота кристаллическая — 20 г, глицерин — .40 мл, дистиллированная вода — 20 мл.

Для прижизненной окраски грибов используют как основные (ген- циановый фиолетовый, метиленовый синий, сафранин, нейтральный красный, метиловый фиолетовый), так и кислые (эритрозин) краски в концентрации 1 : 500, 1 : 1000, 1 : 10000.