ПРИОННЫЕ ИНФЕКЦИИ

Ситуация, связанная с прионными инфекциями, в последние 10 лет стала серьезной проблемой как в медицинской, так и в ветеринарной науке и практике.

Известны медленно протекающие инфекции, при которых макроорганизм не отвечает иммунологической реакцией.

Для подострых спонгиоформных энцефалопатий характерно то, что возбудитель их реплицируется, не вызывая гибели клеток, обеспечивающих его репродукцию, и эти клетки не изменяются в такой степени, которыми можно объяснить появление симптомов заболевания. Так, например, при скрейпи и энцефалопатии норок организм не реагирует на присутствие и репликацию возбудителя. После инфицирования лимфоидной ткани он проникает в мозг, где воспроизводится, возможно в астроцитах, что приводит к медленной дегенерации нейронов. Видимо этот процесс отмечается при таких формах патологии человека, как куру и болезнь Крейцфельда-Якоба.

При медленных прионных инфекциях патологические изменения проявляются поздно и не сопровождаются воспалением. Преобладают пролиферативные и дегенеративные изменения. Каждая из этих энцефалопатий имеет сходное прогрессирующее клиническое течение с летальным исходом и сходные гистопатологические изменения (вакуолизация нейронов, status spongiosus серого вещества головного мозга, пролиферация и гипертрофия астроглии без признаков воспалительной реакции, которая обычно встречается при других инфекциях. Возбудители куру и болезни Крейцфельда-Якоба (БКЯ) патогенны для некоторых видов обезьян, а возбудитель БКЯ - также и для кошек. У паукообразных обезьян болезнь протекает медленно, у мармозеток и саймири - остро.

Куру - эндемическая болезнь, встречающаяся только среди народности Форе, населяющей восточное плоскогорье Новой Гвинеи. Постепенное исчезновение этой болезни является следствием прекращения ритуального поедания мозга погибших от куру людей (естественная передача инфекции). Однако, соседние народности, также поедающие мозги погибших родственников, никогда не болеют куру, что позволило предположить роль генетического фактора в чувствительности к данной болезни.

Основные клинические признаки трансмиссивных губкообразных энцефалопатий (ТГЭ -

transmissible spongiform encephalopathies) обусловлены медленно прогрессирующими расстройствами нервной системы: отклонения в психическом и умственном состоянии, положении тела и координации движений (атаксия, тремор, миоклонус), нарушение реактивности, а также облысение и пигментация. Наиболее характерные патологические изменения, которые можно наблюдать при световой микроскопии мозга, - дегенерация нейронов, гиперплазия и дегенерация астроцитов, формирование амилоидных бляшек (7).

Экстракты мозга больного содержат большое количество характерных амилоидных скрейпи-ассоциированных фебрил (САФ), видимых при негативном контрастировании под ЭМ. Известно, что САФ представляют собой агрегаты мембранного сиалогликопротеина (прионного белка, РгР) с мол.м. 33-35 кД, кодируемого геномом хозяина. У неинфициро- ванных животных существует только нормальная изоформа, не способная образовывать САФ. Прион как термин обозначает белковоподобную частицу очень маленького размера. Прион - Proteinacous infections particles - общее обозначение инфекционных агентов с ви- русподобными свойствами (пггаммовая вариабельность, способность к мутациям), но отли- мающихся от вирусов необычной устойчивостью к высоким температурам, УЗ, ионизирующему облучению, химическим дезинфектантам. Прионный белок существует в 2 изоформах -

нормальной или клеточной (РгРс) и аномальной, или патологической, способной образовывать САФ (РгРЧс). Их различия не зависят от аминокислотной последовательности, поскольку они аналогичны. Свойства изоформ обусловлены посттрансляционной модификацией РгР, которая происходит в процессе инфекции. Функции нормальной изоформы РгР в клетке до конца не выясиеиы. Предполагается ее участие в межклеточном узнавании и клеточной активации. В иорме гены, связанные с чувствительностью к ТГЭ, предположительно определяют старение, их функцией является подавление возрастных процессов и болезней (1, 2). РгР с мол.м. 33-35 кД состоит из 254 аминокислот, включая 22-члеииый Ы- терминальный сигнальный пептид. Это трансмембранный протеин, пересекающий мембрану по крайней мере дважды. Детергентная экстракция солюбилизирует РгРс, ио индуцирует реполимеризацию РгР80 в амилоидные фибриллы. Протеинкиназа К гидролизует РгРс, но расшипляет РгР80 с образованием РгР 27-30, который является дериватом РгРБс и мажорным компонентом инфекционного приона.

За основу принята не генетическая, а модификационная природа образования патогенной изоформы РгР и, как следствие, инфекционности приона. Это обеспечивает патогену эи- до- и экзогенную инфекционность, преодоление межвидовых барьеров и обусловливает эпидемиологические особенности ТГЭ. В настоящее время различают инфекционную, наследственную и спорадическую формы прионных болезней (6).

Болезнь Крейцфальд-Якоба диагностируют спорадически во всем мире.

Массовое заболевание КРС в Великобритании ГЭ в результате скармливания боенских отходов от овец, больных скрейпи, а также случаи заболевания при этих же условиях диких животных в зоопарках и домашних кошек показало возможность преодоления прионами межвидовых барьеров. Это насторожило мировую ветеринарную и медицинскую общественность. В последнее время широко дискутируется возможность заболевания губкообразной энцефалопатией человека при употреблении в пищу мяса и внутренних органов животных, инфицированных прионами. Прионные инфекции из чисто ветеринарной стали социальной проблемой (3).

Гипотезы о природе прионов

После установления возможности передачи скрейпи в экспериментальных условиях овцам и козам были предложены вирусная, вироидная, белковая, полисахаридная, мембранная и др. гипотезы о природе агента скрейпи.

Вирусная гипотеза базировалась на малых размерах возбудителя, его инфекционности, фильтруемости и неспособности расти на питательных средах. Главным возражением против вирусной теории служит необычайно высокая резистентность возбудителя к УФ лучам, ионизирующей радиации и нуклеазам.

Вироидная гипотеза предложена после того, как были открыты возбудители ряда болезней растений (1971). Вироиды - односпиральные циркулярные РНК длиной 246-375 нуклеотидов. Они не кодируют белок и размножаются с помощью клеточной ДНК-зависимой РНК- полимеразы. Важным аргументом против вироидиой гипотезы агента скрейпи является высокая устойчивость его к рибонуклеазам, которые легко разрушают вироиды.

Белковая природа приона основана на том, что агент скрейпи является самореплици- рующимся белком. В клетке нет механизмов, с помощью которых бы белок обеспечивал синтез белка без участия НК.

Полисахаридная и мембранная гипотезы предполагают, что агент представляет собой вид полисахарида или часть измененной клеточной мембраны. Эти гипотезы носят достаточно умозрительный характер.

Прионная концепция возбудителей ТГЭ человека и животных

К началу 80-х годов в лаборатории С.Прузинера (Калифорния) разработан простой метод получения очищенного и концентрированного агента скрейпи из мозга зараженных сирийских хомячков. Полученный белок с мол.м. менее 50 кД обладал инфекционностью. Именно Прузинер высказал предположение, что возбудители ГЭ животных и человека представляют собой белковые инфекционные частицы (proten infectious particles) или при- оны - название образовано путем транслитерации начальных букв первых двух слов наименования возбудителей. Благодаря высокой степени очистки удалось изучить структуру и состав агента. Большая часть инфекционной фракции центрифугированного материала состоит из одного белка, обозначенного как прионный белок (PrP - prion protein) с мол.м. 27-30 кД. При ЭМ очищенного материала обнаружены палочковидные структуры диаметром 10- 20 нм и длиной 100-200 нм. Они состоят примерно из 1000 молекул прионного белка. Все попытки обнаружения в очищенном материале НК оказались безуспешными. Несмотря на то, что вопрос о природе инфекционного агента при ТГЭ до сих пор не получил однозначного ответа, прионная концепция их этиологии представляется наиболее предпочтительной - РгР 27-30 специфичен, «репродуцируется» в культурах клеток неврального происхождения, выделяется совместно с инфекционным прионом при различных процедурах очистки; при этом РгР 27-30 - основная макромолекула в очищенных препаратах приона, концентрация его соответствует титру инфекционности и др. Прионная концепция этиологии ТГЭ не имеет противоречий и слабых мест, объясняет ряд фактов, не укладывающихся в общепринятые микробиологические представления о возбудителе инфекций (2).

Существует ядерная гипотеза, которая не исключает предположения о матричной функции аномальной изоформы для конверсии РгРС в PrPSC по типу шаперона, белка, присутствие которого необходимо при сборке мультимолекулярных или надмолекулярных биологических структур (клеточных, ферментных олигомерных агрегатов), которые не входят в состав конечного продукта, но необходимы для своевременного и парвильного сворачивания полипептидной цепи агрегируемого белка, ее транспортировки к месту сборки и включения в агрегационный процесс.

Морфология и химический состав возбудителя

В 1 г инфицированного мозга содержится более 107 ЛД возбудителя куру - при такой концентрации вобудитель мог бы быть обнаружен под ЭМ. Однако даже во фракциях инфицированного мозга, разделенных в градиенте плотности при ультрацеитрифугировании, не было обнаружено других частиц, кроме клеточных мембран.

Возбудители куру и БКЯ устойчивы при 85°С в течение 30 мин, очень устойчивы к действию некоторых физических и химических факторов.

АГ активность возбудителей куру и болезни Крейцфельда-Якоба не установлена.

Получение прнонного белка в очищенном виде и специфических АТ, установление аминокислотной последовательности части полипептидной цепи прионного белка и синтез по- линуклеотидных зондов явились основой для проведения молекулярно-биологических исследований прионов человека и животных.

К настоящему времени определены нуклеотидные последовательности гена РгР человека, некоторых видов хомячков, мыши, крысы, овцы, КРС ( 13,14,18,19)). Открытая рамка считывания кодирует полипептид, состоящий, например, у КРС из 256 или 264 аминокислот с различной степенью межвидовой гомологии (19). Так аминокислотная последовательность РгР КРС н овцы различается всего 6 остатками, степень гомологии очень высокая и составляет 98%; КРС и человека - уже 30 остатками и 89% гомологии; овцы и человека -33 остатками и 87,5%; хомячка и человека - 27 остатками и 89,33% соответственно. Единичные мутации или дополнительные повторы в определенных положениях последовательности гена РгР человека связаны с проявлением семейных случаев БКЯ и синдрома Герштмана- Штраусслера (СГШ) ((20, 22)). У трансгенных мышей с заменой в гене РгР, соответствующей точечной мутацни в гене РгР пациентов с СГШ, спонтанно проявлялись признаки, подобные таковым при СГШ (15). Мутацнн в разных участках гена связаны с длительностью инкубационного периода при экспериментальном заражении. Последовательность гена определяет видовую специфичность инфекционности при скрейпи (21).

Прионный белок синтезируется во многих тканях н органах человека и животных. Однако, наибольшее его количество выявляют в ЦНС. Прионный белок образуется иа мембранах шероховатого эндоплазматического ретикулума и быстро транспортируется в секреторных везикулах на наружнюю поверхность клетки. В процессе транспорта происходит созревание (процессинг) пригонного белка. От синтезированного полипептида отщнпляется N- концевая сигнальная последовательность, к двум аминокислотам присоединяются олигоса- харидные цепочки, отщипляется также С-концевая последовательность полипептида н к С- концевой аминокислоте укороченного пептида присоединяется глнкозилфосфатилннозитол. Последний удерживает зрелый прионный белок на наружной поверхности клетки путем зая- коривания в плазматическую мембрану.

Функция прионного белка изучена недостаточно, возможно он необходим для функционирования синапсов. Синтезированный в клетке нормальный прионный белок обозначают РгРс - клеточная нзоформа (cellular isoform). Конформационно измененный прионный белок (аномальный, инфекционный) обозначают РгР80 - скрепийная изоформа (scrapie isoform). В последнее время клеточную изоформу прионного белка обозначают PrPsen (proteasesensitive - протеазочувствительный), а скрепийную нзоформу - PrP”* - (protease resistant - протеазорезистентный). Полагают, что все прионные болезни (инфекционной, наследственной или спорадической форм) являются результатом изменения конформации нормального прионного белка. С помощью спектроскопических методов изучена вторичная структура очищенных препаратов Ргрс и РгР8“, полученных в неденатурирующих условиях нз головного мозга здоровых и скрейпи-инфицнрованных хомячков. Установлено, что РгРс имеет высокое содержание а-спиралей (42%) и незначительное содержание ?-складчатых структур (31%). Напротив в PrP8* ?-структуры составляют 43%, а а-спирали только 30%.

В популяции человека или животных первичная структура гена РгР не идентична и может отличаться по нескольким кодонам. Присутствие в популяции 2 или более аллельных вариантов гена обусловливает полиморфизм. Полиморфизм кодона 129 влияет на развитие прнонных болезней человека инфекционной, наследственной и спорадической форм. На передачу инфекционных прионов от одного вида животных другому глубоко влияет последовательность нуклеотидов между 90 и 130 кодонами (90-130 аминокислоты в гене РгР). Чем больше гомология аминокислот в этом участке, тем эффективнее происходит конверсия РгРс в РгР80 под воздействием инфекционного приона.

Вопрос о возможности заражения людей возбудителем ГЭ КРС остро обсуждается с 1994 г после появления в Великобритании нетипичных случаев БКЯ (новый вариант БКЯ) - заболевание развивалось у людей 16-39 лет (в среднем 29 лет), продолжительность ее в среднем 14 мес. Получены доказательства, что новый вариант БКЯ вызывается возбудителем ГЭ КРС - инкубационный период и патология у мышей были аналогичны при введении гомогената мозга людей, погибших от нового варианта БКЯ, КРС и кошек, погибших от ГЭ КРС. Очень сходная патология отмечена у макак, зараженных возбудителем ГЭ КРС. Совсем недавно удалось осуществить конверсию РгрС человека в РгРБс в бесклеточной системе с использованием очищенных препаратов ГЭ КРС и скрейпи овец.

Вопрос об инфекционном агенте (агентах) при ТГЭ не имеет однозначного решения: либо аномальная изоформа РгР является существенным (возможно единственным) компонентом инфекционного начала, необходимым для передачи заболевания, либо она представляет собой побочный патологический продукт в процессе развития инфекции. В первом случае можно говорить о новых «беспрецедентных» инфекционных агентах, для которых давно предложен специальный термин -прионы-, называемых также неканоническими вирусами (12, 18). Как альтернатива предполагается существование неустановленного к настоящему времени вируса, вызывающего амилоидоз мозга.

Конверсия РгрС в РгРБС может происходить спонтанно, под воздействием экзогенного аномального (инфекционного) прионного белка и при мутациях в кодирующей части гена прионного белка. Такая конверсия является посттрансляционной, включает глубокие кон- формационные изменения, которые лежат в основе размножения прионов. Формируется комплекс нормальный-скрепийный прионный белок, к которому присоединяется белок X, функционирующий как шаперон и участвующий в превращении а-спиралей в Р-структуры. Полученный скрепийный прион в свою очередь связывается со следующей молекулой клеточного прионного белка и превращает её в инфекционную форму. Таков механизм накопления РгРЧс в клетках. Синтез Ргр° в инфицированных клетках не изменяется.

Экспериментальная инфекция. К возбудителям наиболее изученных ТГЭ в естественных и экспериментальных условиях чувствительны более 30 видов животных, относящихся к 4 порядкам. Во многих случаях воспроизведена или вполне вероятна оральная трансмиссия как внутривидовая, так и межвидовая. Высокую эффективность орального заражения обеспечивали вполне реальные в естественных условиях дозы (от 0,1 для норок до 130 г для овцы, козы). Интрацеребральное заражение эффективнее орального в 105 раз (23).

В литературе приведены интересные данные о экспериментальной передаче куру. Обезьян шимпанзе заражали мозгом больных куру людей, что вызывало у них заболевание с инкубационным периодом от 14 до 39 мес. После 3-х последовательных пассажей от шимпанзе к шимпанзе инкубационный период сократился до 10-18 мес. Болезнь удалось воспроизвести у 3 видов южноамериканских обезьян: паукообразных, капуцинов и белкообразных. Инкубационный период продолжался от 23 до 45 мес. В серийных пассажах возбудителя на обезьянах инкубационный период сокращался до 16-28 мес. Шимпанзе заболевали при периферическом заражении, при введении больших количеств инфекционного материала непосредственно в желудок заражения не происходило. Это позволяет предположить, что в естественных условиях заражение куру может происходить через поврежденную кожу или конъюнктиву во время каннибализма, а не через пищеварительный тракт.

Механизм передачи болезни Крейцфельда-Якоба неизвестен. Тканью мозга от 12 больных удалось заразить 14 шимпанзе. Инкубационный период продолжался 11-16 мес. Экспериментально удалось также заразить южноамериканских обезьян: паукообразных, капуцинов, белкообразных и шерстистых. После первичного заражения мозгом погибшего челове ка обезьяны заболели с инкубационным периодом 23-29 мес. После заражения этих обезьян мозгом павшего шимпанзе инкубационный период продолжался 9-19 мес. При гистологическом и ЭМ исследовании обнаруживали вакуоли внутри аксонов, дендритов; тела нейронов были окружены фрагментированными мембранами и заполнены фрагментами таких же пролиферирующих мембран. Цитоплазма астроцитов была разбухшей, но без вакуолей. Фрагментированные мембраны цитоплазмы и мембраны, содержащие вакуоли, были сходны с такими же, какие наблюдаются при скрейпи. Однако, таких частиц, которые обнаруживаются при скрейпи, при БКЯ и куру не находили.

Патогенез куру изучается медленно. Инфекционный агент обнаружен во внутренних органах шимпанзе, но еще не доказано присутствие его в организме больного человека.

Культивирование. Агенты, вызывающие куру и БКЯ, были получены в культуре клеток из инфицированного мозга. Возбудитель куру был найден в культуре клеток мозга шимпанзе через 70 дн, а возбудитель БКЯ - в культуре клеток мозга человека через 255 дн. Размножение агентов скрейпи и энцефалопатии норок уже доказано.