ТОКСИНЫ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ТРАХЕОМИКОЗНЫХ БОЛЕЗНЕЙ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ДЕЙСТВИЯ НА ПРИМЕРЕ МАЛЬСЕККО ЦИТРУСОВЫХ

С. АХВЛЕДИАНИ

Научно-исследовательский институт садоводства, виноградарства п виноделия МСХ Грузинской ССР

Трахеомикозные болезни увядания (усыхания), как известно, отличаются от других болезней растения тем, что паразит в данных случаях обитает преимущественно в проводящих ксилемных сосудах (трахеях).

Впоследствии увядание при трахеомикозных болезнях стали объяснять выделением паразитом в растение токсинов, которые поступают в листья с транспирационным током и отравляют их клетки [1] (теория токсинов).

Такого рода механизмы обычно демонстрируются опытами по ускорению увядания: паразит культивируют на питательной среде в течение определенного времени, затем культуральную жидкость фильтруют и в нее помещают растения, отрезанные от корневой системы. Параллельно такие же растения помещают либо в воду, либо в исходную питательную среду (контроль). Если в контрольной жидкости растения увядают позднее, чем в фильтрате культуры, заключают о наличии в последнем токсинов паразита.

В таких опытах единое проявление болезни расчленено на две части — накопление в культуре продуктов жизнедеятельности паразита и воздействие последними на срезанное растение.

Это расчленение осложняет интерпретацию экспериментальных данных. По существу, любая поступившая в растение жидкость окажет на него более или менее вредное действие, если она по составу отличается от обычного транспирационного раствора, подаваемого корнями в растение. Если при этом концентрация вещества в опытной жидкости будет достаточно высокой, растение неминуемо увянет.

В более усовершенствованном варианте метода срезанным растениям дают возможность всосать некоторый объем испытуемого раствора (обычно до появления явных признаков увядания), а затем переносят в воду [1]. Обратимость процесса, т. е. восстановление тургора растения, рассматривают как доказательство того, что в испытуемом растворе отсутствуют токсические вещества, а продолжающееся увядание — как доказательство наличия таковых.

Поскольку увядаиие листьев — самая общая реакция растения на любые неблагоприятные изменения факторов внешней среды и состава внутренней, то даже тогда, когда увядание действительно вызвано отравлением клеток растения токсическими веществами, выделенными паразитами в культуральную жидкость, нет уверенности в том, что именно ими повреждаются растения при болезни. Эта неуверенность обусловлена общеизвестной сильной зависимостью химизма грибов от состава питательной среды и условий культивирования; вполне возможно, что гриб, развиваясь в лабораторных условиях, образует вовсе не те токсические вещества, которыми он умерщвляет растения, обитая в сосудах последнего.

Это обстоятельство в общей форме подчеркивается Б. А. Ру- биным и Е. В. Арциховской [2] при определении термина «токсин» и более конкретизировано В. Ф. Купревпчем [3], а также Даймондом и Уэггонером [4]. Последние предложили для обозначения токсических веществ, образующихся в растении, специальный термин «вивотоксин», широко применяющийся в зарубежной литературе. Вивотоксин, по мнению указанных авторов, — это вещество, продуцируемое в инфицированном хозяине патогеном, самим хозяином пли тем и другим, участвующее в развитии симптомов болезни.

В.              Ф. Купревич совершенно справедливо считает недопустимым причислять к токсинам гриба вещества, образующиеся клетками больпого растения, если даже они способны вызывать симптомы заболевания.

Следует добавить, что накопление растительными клетками в избыточном количестве нормального метаболита хотя и может вызвать симптомы болезни, но само это накопление — уже следствие действия на растения токсинов паразита. Поэтому указанные метаболиты нельзя принять за первопричину гибели растения, т. е. за токсины.

Даже в том случае, когда паразит вызывает гибель растения такими своими выделениями, которые в то же время являются нормальными метаболитами растения, вряд ли целесообразно именовать их вивотокспнами (пли токсинами), как это делают Даймонд и Уэггонер по отношению к этилену и этанолу.

В таких случаях предпочтительнее говорить, что паразит отравляет растение этиленом или этанолом; при этом само собой будет подразумеваться, что эти продукты нормального метаболизма растительной клетки вырабатываются паразитом в повреждающем количестве.

С другой стороны, по мнению В. Ф. Купревича, токсические Еещества, образованные вне тела паразита, но посредством экзоферментов последнего, также не следует именовать токсинами патогена. Такое ограничение нам кажется нецелесообразным по следующему соображению: раз данное вещество вызывает специфические симптомы инфекционной болезни, оно должно быть в определенной степени специфическим продуктом жизнедеятельности именно этого паразита.

Вне клеток паразита такое вещество может образоваться одним из следующих путей:

1. неспецифический экзофермент паразита превращает неспецифический, неактивный ингредиент внешней среды в ядовитое для растения вещество;
2. специфический экзофермент паразита превращает неспецифический, неактивный ингредиент внешней среды в токсин;
3. паразит выделяет вовне специфический предшественник (протоксин), который превращается специфическим же экзоферментом паразита или без него в токсин.

Поскольку образовавшееся первым способом вещество не может быть специфическим продуктом жизнедеятельности паразита, то его, естественно, не следует рассматривать в качестве токсина.

В остальных случаях накапливающееся во внешней среде вещество, обладающее способностью вызывать специфические симптомы данной болезни, образуется только в результате жизнедеятельности данного паразита. Вопрос о месте синтеза такого вещества — в клетке или вне клетки паразита — касается механизма его образования.

Действительно, до настоящего времени из культуральных сред, на которых выращивались паразитарные грибы, изолировано большое число ядовитых веществ. Между тем истинным средством поражения растения (токсином) общепризнаны всего лишь 2—3 соединения, а вопрос об отнесении остальных к токсинам дискутируется в продолжение многих лет.

Тем не менее изолирование токсинов, выяснение их химического строения и изучение механизма действия на растительные клетки имеет не только теоретическое, но и практическое значение. Дело в том, что биосинтез токсина имеет место у паразита, но отсутствует у растения. Следовательно, вещество, которое может блокировать этот биосинтез, предотвратит образование токсина, не затрагивая растения. Поэтому такое вещество можно использовать в качестве вмсокоспсцифичеекого средства для лечения больного растения. Есть все основания предполагать, что структурные аналоги предшественников токсина и будут обладать именно таким действием.

Ту же цель можно достигнуть не только путем предотвращения образования токсинов, но и путем их обезвреживания в самом растении. Располагая изолированным токсином, поиски такого обезвреживающего агента должны вестись несравненно быстрее и при значительно меньших затратах, чем это делается в настоящее время.

Однако изолирование истинных токсинов происходит пока еще очень медленно, несмотря на то что современные методы позволяют проводить такую работу довольно легко. Для этого необходимо иметь точное определение токсина, позволяющее конкретизировать признаки, которые отличают токсины от других продуктов жизнедеятельности паразитов.

По-видимому, ни одно из предложенных определений не удовлетворяет этому требованию, потому что все они игнорируют самую характерную особенность токсина — ядовитость для растительных клеток.

Следовательно, при определении токсина необходимо учитывать способность его в больших концентрациях убивать клетки данного растения, а в сублетальных — вызывать их отравление.

На основании вышесказанного предлагаем следующее определение: токсином паразита называется вещество, которое образуется в результате его жизнедеятельности в растении-хозяпне и в сублеталыюи концентрации вызывает появление специфических симптомов болезни путем непосредственного нарушения нормального обмена соответствующих растительных клеток [12].

Даймонд и Уэггонер [4], исходя из предложенного ими определения, считают, что для признания того или иного вещества вивотоксином необходимо и достаточно соблюдение следующих условий: 1) это вещество должно быть выделено из больного растения[I]; 2) при его введении в здоровое растение у последнего должен развиться какой-либо специфический симптом болезни. К этим условиям следует добавить необходимость доказательства ядовитости токсина по отношению к клеткам данного растения.

Итак, нам представляется, что главная трудность изолирования токсинов заключается в отсутствии точно охарактеризованного специфического симптома болезни, который можно было бы использовать в качестве теста. При этом данный симптом должен быть результатом нарушения обмена вещества, а не смерти растительной клетки, поскольку летальный исход исключает возможность «узнавать» токсин.

Трахеомикозная болезнь усыхания цитрусовых (мальсекко) имеет весьма важное экономическое значение: только по южной части Черноморского побережья Грузинской ССР за последние 25 лет от нее погибло свыше 1,5 млн.

Возбудитель этой болезни — факультативный паразит Deute- rophoma tracheiphila Petri обитает в ксилемных проводящих сосудах. Кияшко [13], Поляков и Шумакова [14] высказали предположение, что гибель лимонных деревьев обусловлена токсическими выделениями паразита. В последующие годы это предположение приняли все исследователи.

Неспецифическими симптомами болезни являются хлороз- листьев, которые затем обычно опадают, и пожелтение коры пораженной ветки, особенно ее верхушечной части, приводящее к полному отмиранию.

Характерный признак мальсекко — красновато-оранжевая окраска древесины в виде кольцевого сегмента, иногда же окрашенным бывает весь торец среза. Оршанская [15, 16] показала, что при смачивании торца срезанной ветки 1%-ным раствором едкого натра окраска становится значительно интенсивнее. Тоже подтвердили Бацци и Скривани [17].

Кроме того, в ксилемных проводящих сосудах очень часто обнаруживается скопление темно-коричневого гумми-подобного вещества, часто наблюдается локальное почернение камбиального слоя.

Клетки, окружающие зараженные мицелием проводящие сосуды, бывают заполнены зернистой массой оранжевого цвета, что и является причиной окраски среза.

По мнению Гасснера [18], Сулакадзе и других [19—20], закупорка проводящих сосудов гумми-образными веществами вызвана действием холода на лимонные деревья. Другие исследова-

дуктами обмена самого растения, во-вторых, на отмерших растениях обычно обитают и другие, вторичные микроорганизмы, которые могут принимать участие в развитии синдрома болезни. Поэтому если они по активности и количеству выделения будут значительно превосходить возбудителя, то эги выделения можно ошибочно принять за истинные токсины. Одновременно следует изолировать последние и из чистых культур,.

тели считают, что это явление есть результат жизнедеятельности паразита.

Закупорке кснлемных проводящих сосудов аморфной массой описана в случае многих болезней: голландской болезни вяза [21—24], болезни увядания дуба [25, 26], японской хурмы [27], бананов [28], красной гвоздики [29], косточковых [30, 31], гладиолусов [32—34].

Людвиг [35, 36] считает, что при трахеомикозных болезнях увядание наступает из-за недостаточного водоснабжения. С помощью изотопного метода к такому же заключению пришли Бекман, Кунтц и сотр. [26], Центмейер и сотр. [37] и Уэггонер и Даймонд [38].

Общее одобрение получило следующее объяснение скопления в сосудах аморфного вещества (эмбол). Возбудители трахеомикозных болезней, обитая в проводящих сосудах, выделяют маце- рирующие ферменты, которые расщепляют срединные пластинки на фрагменты. Последние поступают в сосуды и вновь полимери- зуются в них [6, 39—51].

Первые же опыты убедили нас, что культуральная жидкость, на которой выращивался возбудитель мальсекко, а также экстракт из древесины больного дерева, вызывает закупорку проводящих сосудов лимонных побегов и сеянцев томата [52]. Следовательно, закупорка является следствием инфекции. В тех же опытах обнаружено, что мацерация тканей имеет место лишь в той части побега, которая примыкает к срезу, а закупорка сосудов наблюдается на всем их протяжении.

Между тем простой расчет показывает, что если даже весь материал стенок сосуда и первого ряда околососудистых клеток растворится и пойдет на образование эмбол, то последние должны содержать сухих веществ не более 6% вместо наблюдаемых 90% и выше.

Поэтому мы предположили, что эмболы образовались либо из компонентов культуральной жидкости, либо являются продуктом нарушенной под влиянием выделений паразита жизнедеятельности околососудистых клеток. Очевидно, что в последнем случае мы имеем тест для обнаружения токсина, удовлетворяющий самым строгим требованиям.

Эмболообразующему токсину возбудителя мальсекко присвоили название мальсеккотоксин А [35]. Предварительными опытами было установлено, что этот токсин выпадает в осадок при подкислении сконцентрированного раствора, а также при добавлении раствора ацетата свинца и растворяется в щелочах. Мальсеккотоксин А, кроме того, экстрагируется бутанолом при pH 2,5 и обратно переходит в водную фазу при pH 6,5, обратимо адсорбируется на окиси алюминия из водных растворов и необратимо на примененных анионитах (АВ-16, ЭДЭ-10, АН-9 и АН-1) [54].

Изолирование токсина проводилось следующим образом. Колбы на 2—3 л заполнялись раздробленной древесиной здорового лимона почти до горлышка и заливались водой на высоту около 15 мм. После стерилизации текущим паром субстрат засевался кусочками мицелия возбудителя мальсекко. Через 45 — 90 дней колбы вскрывались, освобождались от культуральной жидкости, а твердый субстрат экстрагировался водой в продолжение 24 час.

Смесь культуральной жидкости и экстракта пропускалась через короткий слой окиси алюминия (8,4 см) со скоростью 19 мл/час • см2. При этом верхний слой адсорбента окрашивался в темно-коричневый цвет. Промывание колонки проводилось с той же скоростью эмпирически подобранными вытеснителями ь следующей последовательности: 0,1 М раствор сульфата калия (pH 7) —0,1 М фосфатный буфер (pH 9) —0,1 н. раствор гидрата окиси калия.

При перерыве в ходе хроматографирования зона, отмываемая фосфатным буфером, оставляла след на адсорбенте. Этот след начинал передвигаться только при промывании колонки раствором гидрата окиси калия.

Для биоиндикации пробы элюатов и исходной культуральной смеси подкислялись, экстрагировались двумя порциями бутанола (одинаковыми для всех проб объемами), а затем реэкстрагиро- вались 0,05 н. КОН. Щелочные вытяжки после нейтрализации освобождались от растворенного бутанола упариванием в вакууме до */з взятого объема вытяжки. Затем все концентраты разбавлялись до 200 мл и в них помещались отрезанные под водой побеги лимонов и всходы томата. Через 18, 24, 30 и 48 час. отмечалась степень увядания, после чего из стебля через каждые 5 мм готовились срезы средней толщины.

Результаты биоиндикации приведены в табл. 1.

Данные табл. 1 свидетельствуют о толі, что весь имеющийся в культуральной смеси мальсеккотоксин А перешел в фосфатный элюат. Кроме того, эти результаты указывают также на корреляцию скоростп увядания с закупоривающим действием мальсек- котоксина А как в случае томата, так и лимона.

Для выделения мальсеккотоксина А фосфатный элюат отмывался при pH 0,5 тремя порциями бутанола, затем подкислялся до pH 2,2 и экстрагировался два раза бутанолом. При этом выпадала твердая фаза темно-коричневого цвета, которая вызывала только некроз клеток лимонного побега. Бутанольная фаза отмывалась цитратным буфером pH 2,5, затем водой один раз и ре- экстрагировалась 0,05 н. раствором гидрата окиси натрия. Нейтрализованная 0,1 п. серной кислотой и сконцентрированная до ]/бо первоначального объема щелочная вытяжка при под- кислении образовывала труднофильтруемый хлопьевидный осадок. Выделение мальсеккотоксина А заканчивали следующим

Примечание: числитель — время увядания в часах; знаменатель — степень закупоривающего действия: ' почти все сосуды закупорены;

эакупорепо не менее 20°/о сосудов; закупорены лишь единичные сосуды;

— отсутствует закупорка во всех сосудах.

образом: выпавший при подкислении концентрата осадок растворялся добавлением примерно двух объемов метанола, который затем в вакууме медленно удалялся из раствора. Выпадающий осадок имел темпо-коричневый цвет и легко отфильтровывался.

При переработке 7 л культуральной смеси, полученной из 820 г древесины, было выделено 565 мг мальсеккотоксина А.

Чтобы предотвратить изменения токсинов во время длительного хроматографирования, культуральную смесь сгущали путем экстрагирования бутанолом и последующим реэкстрагированием

0. 05 н. раствором едкого натра.