ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ УСТОЙЧИВОСТИ ХЛОПЧАТНИКА К ВОЗБУДИТЕЛЮ ВЕРТПЦИЛЛЕЗНОГО УВЯДАНИЯ

П. П. ГУСЕВА, Е. Г. С АЛЬ КОВ А,

О.              Л. ОЗЕРЕЦКОВСКАЯ

Всесоюзный институт защиты растений, Институт биохимии им. А. Н. Баха АН СССР

Задачей настоящих исследований являлось выяснение роли пектолитпческих ферментов и фенольных соединении в устойчивости хлопчатника к возбудителю вилта — грибу УеНісіШит йак- Иае.

Объектами исследований были 2 штамма: шестой, сильно агрессивный, черный, образующий микросклероции в массе, и первый, слабоагрессивный, белый, не образующий микросклероции. Мицелий гриба выращивали на среде Чапека-Докса с различными источниками углерода. Активность ферментов заметно варьировала на разных средах. Наименьшей активностью обладали грибы, выращенные на среде с глюкозой, наибольшей — грибы, выращенные на среде с пектином. Это дало нам основание отнести пектолптические ферменты гриба V. йаМіае к адаптивным ферментам.

Активность пектолитпческих ферментов — пектннэстеразы и полигалактуроназы — определяли в культуральной среде после удаления мицелия и в самом мицелии [1]. Мицелий гриба экстрагировали водой в течение 2 час. и из экстракта осаждали белок сернокислым аммонием, добавляя его до 0,7 от полного насыщения. Осадок отфильтровывали, растворяли в воде и пропускали через колонку с сефадексом С-50. Фракции элюата собирали порциями по 5 мл. Содержание белка во фракциях определяли спектрофотометрически по поглощению при 260—280 ммк. Аналогичным образом очпщалп и ферменты культуральной среды.

Об активности пектинметилэстеразы — фермента, отщепляющего метильные группы от пектина, — судили по увеличению кислотности после его инкубации с пектином. Для этого к пробе, содержащей фермент, 10 мл 1%-ного пектина п 2 мл 1 и. ЛаС1, добавляли 0,1 н. КОН до pH 5,2. Количество щелочи в миллилитрах служило мерой активности фермента. Активность полига- лактуроназы — фермента, расщепляющего цепочку полигалакту- роновой кислоты на отдельные фрагменты, определяли по приросту восстанавливающих сахаров, по уменьшению вязкости пектиновых растворов и по приросту галактуроновой кислоты. В последнем случае проводили хроматографическое отделение галактуроновой кислоты и ее количественное определение по реакции с хлористым трифенилтетразолием [2].

Активность пектолитических ферментов тесно связана со степенью агрессивности штамма: чем агрессивнее штамм, тем более активны пектолитические ферменты. Так, у агрессивного шестого штамма гриба активность пектинметилэстеразы в 1,5 раза выше, чем у менее агрессивного первого штамма. Полученные нами данные находятся в соответствии с данными Лила и сотрудников [3]. Эти авторы нашли, что пектолитические ферменты вырабатываются только патогенными штаммами V. dahliae и ни у одного из сапрофитных штаммов не обнаруживаются.

В наших опытах активность пектинметилэстеразы (в мл 0,1 н. NaOH на 10 г пленки мицелия) составляла в мицелии 1,5, а в культуральной среде — 1,6. Активность полигалактуроназы (в мг моносахаров на 10 г пленки мицелия) была соответственно

0. 16 и 0,17.

По-видимому, при культивировании гриба на жидкой среде устанавливается определенное равновесие между скоростью образования ферментов и их выделением в культуральную среду.

Погружение проростков хлопчатника в растворы ферментов приводило к их увяданию. Наиболее чувствительными оказались проростки в фазе семядольных листьев и молодые растения в фазе шестого-седьмого настоящего листа. Напротив, проростки в фазе первого-пятого настоящего листа отличаются повышенной устойчивостью к заражению и, как следствие этого, к увяданию в растворе пектолитических ферментов.

Скорость увядания в растворе фермента зависит от активности последнего: чем активнее пектолитические ферменты, тем скорее наступает увядание. С другой стороны, скорость увядания зависит и от степени устойчивости сорта: более устойчивые сорта увядают медленнее, менее устойчивые — быстрее. Характерно, что устойчивые растения, перенесенные из раствора фермента в воду, восстанавливают тургор тканей, тогда как неустойчивые сорта не восстанавливают. Эффект увядания вызывали не только пектолитические ферменты гриба V. dahliae, но и других возбудителей, например Fusarium oxysporum и F. uasinfectum.

Увядание растений хлопчатника при погружении их в растворы пектолитических ферментов, а также его отсутствие в рас- творах инактивированных ферментов свидетельствуют о том, что вертициллезное увядание тесно связано с действием пектолитпческих ферментов грпба. Подтверждением этого служат и полученные нами даті шло о появлении свободной галактуронпвой кислоты в растениях восприимчивых сортов после погружения в растворы эгах ферментов. В растениях устоилпвілх сортов галактуроновая кислота не образуется. Возможно, что фермент не проникает так глубоко в растение вследствие его ннактивпрова- НІ1Я тканями хлопчатника. Одним из механизмов такого ннакти- вирования может быть действие фенольных соединений.

Рис. Поражаемость хлопчатника вертицпллезным вилтом в онтогенезе

1. — семядоли; 2 — первый настоящий лист; з — второй на- стоящий лист; 4 — третий настоящий лист; «5 — четвертый настоящий лист; 6 — пятый настоящий лист; 7 — шестой-седьмой настоящий лист; 8 бутонизация; 0 — цветение

В ответ на внедрение гриба в растении хлопчатника происходит существенное изменение в составе и количестве фенольных соединений [4].

Количественное определение фенольных веществ проводили но методу Суэйна [5] с реактивом Фолина-Дениса. Для анализов использовались спиртовые вытяжки из тканей здоровых и зараженных растений. Заражение проводили в фазе семядолей. Экстракты готовили на четвертый день после заражения. Полученные результаты приведены в табл. 1.

Как видно из приведенных данных, наиболее высоким содержанием фенольных соединений характеризуются восприимчивые сорта, напротив, в устойчивых их содержание незначительно. По при заражении картина резко меняется. В восприимчивых сортах содержание фенольных соединений несколько понижается (на 25—30 %), у среднеустойчивых сортов почти не изменяется, а у устойчивых заметно возрастает.

Хроматографическое изучение этой группы соединений показало, что в тканях устойчивых сортов после заражения появ-

Содержание фенольных соединений в здоровых и зараженных растениях хлопчатника

ляется ряд новых веществ, таких, как кофейная кпслота и вещество с -А/=0,53, имеющее характерное свечение (предположительно окопилпн). Инчересно, что хлорогеновая кислота, которая присутствует в тканях здоровых растений, в зараженных тканях устойчивых сортов исчезает, вероятно, вследствие окисления и расщепления, о чем свидетельствует факт появления кофейной кислоты.

Присутствие этих соединений, обладающих яркой флуоресценцией, объясняет свечение жилок у зараженных внлтом растений хлопчатника. Это свечение наблюдается преимущественно у устойчивых сортов.

Наличие ряда фенольных соединений в зараженных тканях хлопчатника дало основание испытать их действие на рост возбудителя внлта в искусственной культуре. Было изучено влияние хлорогеновой и кофейной кислот п продуктов нх окисления. Окисление осуществлялось препаратом полнфенолоксттдазы. Определялись рост грпба (по весу мицелия) и активность пектолити- ческнх ферментов, выделяемых в культуральную среду. Полученные данные представлены в табл. 2.

Наиболее токсичной оказалась кофейная кпслота, которая в концентрации 0,1 мг/мл полностью подавляла рост гриба. Хло- рогеновая кислота в концентрации 2 мг/мл значительно стимулировала рост гриба, а в концентрации 0,1 мг/мл практически на него не влияла. Аналогичные данные по влиянию хлорогеновой кислоты на рост гриба Phytophthora infestans были получены

В.              Е. Соколовой и сотр. [6]. Стимулирующее действие хлорогеновой кислоты на рост грибов связано с присутствием в ее молекуле остатка хинной кислоты, являющейся, как известно, хорошим субстратом для роста грибов. Хлорогеновая кислота

Влияние фенольных соединений на рост V. с1а11/нк' и активность его пектолитических ферментов

в концентрации 0,1 мг/мл, предварительно окисленная иолпфе- нолоксидазой, очень сильно подавляла рост гриба и активность, ьыделяемых им пектолитических ферментов.

Есть все основания предполагать, что подобным же образом могут действовать окисленные производные хлорогеновой кислоты и в тканях зараженных растений хлопчатника. Эти окисленные продукты связывают пектолитические ферменты патогена и тем. самым препятствуют его распространению по тканям растения.

На основании проведенного изучения взаимоотношении возбудителя вертпциллезного увядания и растения-хозяина хлопчатника нами были предложены и апробированы на коллекции ВИРа два следующих метода.

1. Определение степени устойчивости образцов по их способности активировать синтез фенольных соединений. 2. Определение степени увядания хлопчатника в пектолитических ферментах гриба (культуральной среде) с учетом обратимости увядания после помещения увядших всходов в воду. Оба метода применимы для оценки устойчивости растений в фазе 6—7'го настоящего листа.

Предложенными методами было оценено более 300 сортов хлопчатника отечественной и зарубежной селекции, полученных из коллекции ВИРа. Из сортов вида Соэзуртт ЫгвШит выделена небольшая группа — 19 относительно устойчивых сортов. Это сорта американской группы Акала, ряд угандских форм, несколько образцов из Центральной Америки п некоторые отечественные сорта (108Ф н др.). Они могут служить основой для селекции хлопчатника на устойчивость к вплту.

1. Е. Г. Салькова, H. Н. Гусева. Пентолитические ферменты возбуди

теля вертпдпллезпого увядания хлопчатника. — Докл. АН СССР, 163, Ж 2, 1965.

2. Е. Г. С а л ь к о в а, Н го К э - с ы о н г. Пентолитические ферменты грибов,

вызывающих загнивание плодов. — Докл. АН СССР, 161, № 1. 1965.

3. J. A. L е а 1, J. R. V i 11 a n u е V a. Lack of pectic enzyme production of non-

pathogenic species of Verticillium. — Nature, 195, 1962.

4. Б. A. P у б и н. JI. М. Перевязк и н а. Роль дубильных веществ в явле

ниях устойчивости хлопчатника к вплту. — Докл. АН СССР, 79, № 2, 1951.

5. Т. Swain, W. E. Н i 11 i s. The phenolic constituents of Prunus domestica.

9. The quantitave analysis of phenolic constituents. — J. Sei. Food and Agric., 10, 1943.

6. В. E. Соколова, О. H. Савельева, В. А. Рубин. Характер превра

щения хлорогеновой кислоты в клубнях картофеля, пораженных Phytophthora infestans. — Докл. АН СССР, 123, № 2. 1958.