РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Мальсеккотоксин А не содержит азота, фосфора, серы и галоидов. Высушенный в вакууме над Р2О5, он начинает темнеть в запаянном капилляре при 92° С и при 96° С совершенно чернеет.

Оптическая плотность вУФ-участке спектра монотонно уменьшается в сторону длинных волн, лишь при 280 ммк наблюдается смазанный пик.

Мальсеккотоксин А вытесняет СОг из двууглекислого натрия, однако в твердом состоянии не реагирует с диазометаном. С РеС1з окрашивания не наблюдается.

Концентрированная серная кислота вызывает моментальное почернение вещества, соляная и азотная кислоты видимых изменений не оказывают.

Проба Молиша на углеводы отрицательна как с самим маль- секкотокспном А, так и с продуктами его гидролиза в кислой (0,11 н. НС1 в 60%-ном этаноле, кипячение до 60 мин.; 50%-ная НС1 в метаноле при 100° С, 4 час.; 98%-ная муравьиная кислота при 175°, 2 час.) и щелочной среде (1 н. раствор едкого натра при 20°, 18 час.).

Водный раствор мальсеккотоксина А моментально обесцвечивает раствор перманганата с образованием бесцветных продуктов окисления.

Бромная вода также обесцвечивается. Полученное желтое бромпроизводное при стоянии с раствором йодистого калия медленно выделяет свободный иод.

Мальсеккотоксин А реагирует как с фенилгидразином, так и с некоторыми его замещенными, однако кристаллический осадок при комнатной температуре образуется лишь с 2,4-динитро- фенилгидразином (в водно-спиртовом растворе). Полученное производное растворяется в этилацетате и хорошо экстрагируется из этого раствора 0,1 н. бикарбанатом натрия, давая красное окрашивание, растворяется в смеси хлороформа и этанола. Рgt; 0,5 н. растворе едкого калия растворяется с ярко-фиолетовым окрашиванием.

Ввиду того, что мальсеккотоксин А обладает кислыми свойствами, а pH культуры возбудителя мальсекко на жидких средах со временем значительно повышается, были поставлены опыты по выяснению роли веществ основного характера этих культур в развитии симптомов болезни. Было установлено, что в указанных культурах образуется аммиак (до 40 мг/л); амины, если и образуются, то их содержание в культуральной жидкости не превышает 10~4%. Дистилляты, полученные в вакууме из культуральных жидкостей с pH 3, 7 и 9, не проявили фитотоксичностп по отношению к всходам томата и побегам лимона.

Ввиду того, что образующиеся в проводящих сосудах эмболы окрашены значительно интенсивнее, чем мальсеккотоксин А, было необходимо выяснить, образованы ли они растительными тканями под влиянием токсина или возникли в результате постепенного накопления последнего в сосудах. С этой целью вода из сосудов отрезков стебля томатного растения, вырезанных под водой, вытеснялась раствором мальсеккотоксина А разной концентрации (0,1 и 0,5%), после чего сосуды перекрывались с обеих концов и сохранялись в горизонтальном положении. Изучение срезов этих отрезков стебля показало, что интенсивность окраски со временем нарастает и через 48 час. сравнивается с цветом эмбол, полученных в обычных условиях. К этому же времени эмболы становятся совершенно нерастворимыми в воде. Они дают положительную реакцию Захариазиса, хорошо окрашиваются нейтральротом и не окрашиваются водным раствором эозина. Микрохимическая реакция с РеС1з отрицательна.

При высушивании срезов под микроскопом в разных сосудах наблюдалось уменьшение объема в разной степени: на 50% и выше в 35% случаев, на 30—50% в 42% случаев, на 15 — 30% в 15% и меньше чем на 15% в 13% случаев.

Поскольку высушенные эмболы также не прокрашиваются эозином даже при нагревании, они являются плотными гелями п, следовательно, количество сухих веществ в них достигает 80—90%. Очевидно, такое высокое содержание сухих веществ не могло образоваться за счет мальсеккотоксина А, введенного в сосуд в виде 0,5%-ного раствора. Поэтому остается допустить, что эмболы образовались из поступивших в сосуд продуктов нарушенного токсином обмена веществ растительной ткани, а не из материала межклетников, срединных пластинок и других мертвых структур. Следовательно, эмболы — прижизненные патологические продукты растительных околососудистых клеток.

Таким образом, показано, что в случае мальсекко инфицированное растение не является совершенно пассивным субстратом внедрившегося в сосуды паразита, как это вытекает из существующей теории, а энергично реагирующим на воздействие токсинов организмом.

Образование эмбол, т. е. гелей с очень высокой вязкостью, несомненно, требует определенного времени, в течение которого вязкость протекающего по сосуду раствора нарастает постепенно. Продолжительность этого процесса при всех прочих равных условиях зависит от концентрации эмболообразующего раствора. Эмболы образуются быстро при высоких концентрациях токсина. В случае малых количеств токсинов при хроническом течении процесса увеличение вязкости транспортируемой жидкости может не достигнуть предела (образования эмбол). Однако возросшая при этом вязкость обусловливает значительное уменьшение подачи воды в листья. Поэтому при большой скорости испарения может наступить усыхание листьев, а затем и растения — задолго до появления эмбол в сосудах. Наоборот, образование эмбол в части сосудов может не вызывать увядания растения, если потребность листьев последнего к водоподаче понижена.

Следовательно, в случае мальсекко увядание растений происходит не столько от закупоривания сосудов, сколько от повышения вязкости транспортируемого раствора; вязкость же повышается в результате поступления в сосуды соответствующих продуктов нарушенной жизнедеятельности околососудистых клеток, обмен которых извращается под воздействием токсина паразита. В известных условиях вязкость может повыситься до образования эмбол.

В заключение отметим, что из древесины лимонного дерева, пораженного мальсекко, было выделено вещество, которое по своим физико-химическим, химическим свойствам и биологическому действию не отличалось от мальсеккотоксина А [55]. Таким образом, изолированное вещество (мальсеккотоксин А) удовлетворяет самым строгим требованиям для того, чтобы признать его истинным токсином, т. е. агентом, посредством которого D. tracheiphila Petri умерщвляет лимонное дерево.

Мы считаем, что такие же явления имеют место и при других трахеомикозных болезнях. Поэтому эмболообразование, или повышение вязкости в проводящих сосудах, может служить тестом для выявления (изолирования) токсинов возбудителей таких болезней.

выводы

1. На основании анализа литературных данных предложено следующее определение токсина: токсином является вещество, которое образуется в результате жизнедеятельности паразита в растенитт-хозяине (внутри или внеклеточно) и в сублетальной концентрации вызывает появление специфических симптомов болезни путем непосредственного нарушения нормального обмена соответствующих растительных клеток.
2. Установлено, что общепринятый метод ускорения увядания непригоден для изолирования токсинов из культуральных сред, так как последние содержат значительное количество разнообразных веществ неизвестной природы, действие которых нельзя элиминировать подбором контрольной жидкости. Кроме того, ускорение увядания не позволяет выявить истинные ТОКСИНЫ в присутствии других ядовитых для растения веществ, которые накапливаются в данной среде и вызывают увядание опытных побегов, но не образуются в растении-хозяине.
   Рассматриваемым методом, по-видимому, можно пользоваться лишь при очистке уже изолированных токсинов.
3. На примере мальсеккотоксина А установлено, что для изолирования токсинов увядания возбудителей трахеомикозных болезней в качестве тест-признака следует принять эмболообразо- вание или в крайнем случае уменьшение водоподачи (повышение вязкости транспнрационного раствора).
4. Мацерация растительных тканей вызывается термолабиль- ньши компонентами нативной культуральной жидкости, предположительно экзоферментами паразита.
5. Разработан метод изолирования мальсеккотоксина А возбудителя трахеомикозной болезни усыхания цитрусовых — мальсекко, характеризующийся тем, что весь процесс выделения производится в очень мягких, почти физиологических условиях: температура ниже 40° С, pH жидкости от 2,5 до 9, хроматография на окиси алюминия в водной среде.
6. Изолированный мальсеккотоксин А вызывает у опытных растений, опущенных в его водный раствор, закупорку ксилемных проводящих сосудов темно-коричневой массой п ускоренное увядание. Последнее хорошо коррелирует со степенью закупорки как в случае лимонных побегов, так и всходов томата.
7. Доказательством того, что мальсеккотоксин А является истинным токсином возбудителя мальсекко, т. е. агентом, посредством которого последний вызывает гибель лимонного дерева, служит следующее: а) изолированный токсин вызывает весьма характерное и специфическое для трахеомикозных болезней повышение вязкости трапспирационной жидкости вплоть до образования эмбол в сосудах; б) из древесины больного лимона, внешне еще здорового, тем же методом изолирования выделено вещество, которое по своим физико-химическим, химическим свойствам и биологическому действию идентично мальсеккотоксину Л.
8. Повышение pH жидких питательных сред при выращивании возбудителя мальсекко обусловлено накоплением аммиака (до 40 мг/л). Органические основания не образуются.
9. Изолирование мальсеккотоксина А позволило установить, что непосредственная причина увядания (усыхания) растения при трахеомикозных болезнях — уменьшение водоснабжения листьев — вызывается поступлением в ксилемные проводящие сосуды гель-образующих продуктов жизнедеятельности растительных клеток, обмен которых нарушен под влиянием токсина.
   В определенных условиях вязкость может увеличиться вплоть до образования плотных гелей — эмбол. Этим показано, что инфицированное растение вовсе не является пассивным субстратом внедрившегося в сосуды паразита, каким оно представляется по существующей теории образования эмбол.
10. Мальсеккотоксин А представляет собой светло-коричневый аморфный порошок, не содержащий азота, фосфора, серы и галоидов. Разлагается при 92° С. Растворим в полярных растворителях и нерастворим в неполярных. УФ-спектр поглощения имеет смазанный пик при 280 ммк, выделяет СОг из бикарбоната натрия, но не реагирует с диазометаном и окрашивания с ГеС1з не дает. Концентрированная серная кислота вызывает моментальное почернение вещества. Проба Молиша отрицательна как до гидролиза, так и после него. Обесцвечивает КМп04 и бромную воду. Бронированный продукт медленно выделяет йод из Ю. С 2,4-динитрофенилгидразином дает кристаллическое производное, пригодное для очистки мальсеккотоксина А.

ЛИТЕРАТУРА

1. E. Gauman, S. Naef-Roth, H. Kern. Zur phytotoxischen Wirksamkeit der Enniantine. — Phytopathol. Z., 40, 1950.
2. Б. A. Рубин, E. В. А p ц и x о в с к а я. Биохимия и физиология иммунитета растений. М., Изд-во АН СССР, I960.
3. В. Ф. К у и р е в и ч. Физиология больного растения. М., Изд-во АН СССР, 1947.
4. A. E. D i m о n d, Р. Е. Waggoner. On the nature and role of vivoto- xins in plant disease. — Phytopathology, 43. 1953.
5. E. Gaiimann. Fusaric acid as a wilt toxin. — Phytopathology, 47, 1957.
6. E. G a u m a n n. Uber die Wirkungsmechanismen der Fusarinsaure. — Phytopathol. Z., 32, 1958.
7. E. Gaumann, O. J a a g. Uber das Problem der Welkekrankheiten bei Pflanzen. — Experientia, 2, 1946.
8. E. Gaumann, O. J a g g. Uber das toxigene und das physikalisch induzierte Welken. — Phytopathol. Z., 16, 1950.
9. A. E. D i m о n d. Pathogenesis in the wilt diseases. — Annual. Rev. Plant Physiol., 6, 1955.
10. D. Gotlieb. The mechanism of wilting caused by Fusarium bulbigenum var. lycopersici. — Phytopathology, 34, 1944.
11. R. P. Schef f er. The wilting mechanism in Fusarium wilt of tomato.— Phytopathology, 42, 1952.
12. К. С. Ахвледиани. Выделение токсинов возбудителей трахеоми- козных болезней и изучение их действия на примере мальсекко цитрусовых. М., автореф. канд. дисс.. 1965.
13. П. И. К п я ш к о. О токсическом действии гриба Deuterophoma tra- cheiphiia, возбудителя инфекционного усыхания лимояов «мальсекко».— Труды ВИЗР, вып. 3, 1951.
14. И. М. Поляков, А. А. Шумакова. Испытание токсических свойств гриба Deuterophoma tracheiphila. — Труды ВИЗР, вып. 3, 1951.
15. В. Н. Оршанская. Некоторые итоги изучения культур гриба Deuterophoma tracheiphila Petri и перспективы их использования в борьбе с болезнью усыхания цитрусовых — «мальсекко». — Изв. АН СССР, серия биол., № 1, 1952.
16. В. Н. Оршанская. Ранняя диагностика инфекционного усыхания лимонных деревьев «мальсекко» и ее применение для контроля черенкового материала. М., Изд-во МСХ и 3 СССР, 1953.
17. В. В a z z i, P. S с г i у а n i. Un metodo diagnostico per il riconscimento del decorso del «mal secco» degli agrumi. — Phytopathol. Z., 21, 1954.
18. G. Gassne r. Untersuchungen uber das «Mal secco» oder «Kurutan» der Limonbaume. — Phytopathol. Z., 13, 1940.
19. Т. C. Сулакадзе. Микроскопические исследования повреждения лимона морозами. — Сообщ. АН Грузинской ССР, 4, 1943.
20. Т. С. Сулакадзе, JI. М. Василевская. Материалы к разграничению морозных и гуммозных повреждений у лимона. — Труды Тбилисского ботанического ин-та, 14, 1952.
21. H. Ahmet. Untersuchungen uber Tracheomykosen. — Phytopathol. Z.,

6. 1933.

22. W. M. Banfiel-d. Distribution by the sap stream of spores of the fungi that induce vascular wilt diseases of elm. — J. Agron. Res., 62, 1941.
23. A. E. D i m о n d. Symptoms of Dutch elm disease produced by toxins of Graphium ulmi in culture. — Phytopathology, 31, 1947.
24. G. A. Zentmever. Toxin formation by Ceratostomella ulmi. — Science, 95, 1942.
25. C. H. Beckman, J. E. К u n t z, A. J. R i k e r, J. О. В e r b e e. Plugging o! vessels associated with oak wilt development (abstr.). — Phytopathology, 42, 1952.
26. C. H. Beckman, J. E. К u n t z, A. J. R i k e r, J. О. В e r b e e. Host responses associated with the development of oak wilt. — Phytopathology, 44, 1954.
27. R. S. Crandall, W. L. Baker. The wilt disease of American persimmon, caused by Cephalosporium diospyri. — Phytopathology, 40, 1950.
28. О. T. Pag e. Fusaric acid in banana plants infected with Fusarium oxysporum f. cubense. — Phytopathology, 49, 1959.
29. P. E. Nelson, J. T a m m e n, R. Baker. Control of vescular wilt diseases of carba by culture-idexing. — Phytopathology, 50, 1960.
30. Т. А. Ц а к а д 3 e. Действие токсина Cytospira leucostoma па клетку растения. — Бюлл. ГБС, вып. 35, 1959.
31. Т. А. Ц а к а д з е. Усыхание и камедетечение (гуммоз) косточковых культур в Грузии. Тбилиси, автореф. докт. дисс., 1963.
32. Е. Г. К л и н г. К физиологии гладиолусов. — Бюлл. ГБС, вып. 8, 1951.
33. Е. Г. К л и н г. О болезни желтения гладиолусов. — Бюлл. ГБС, вып. 19, 1955.
34. Е. Г. Клинг. К физиологии гладиолусов при болезни желтения.— Бюлл. ГБС, вып. 30, 1958.
35. R. A. L и lt;3 w i g. The physiology of hydromycotic wilting in plants with special reference to tomato wilt. Thesis, McGill Univ., Toronto, 1947. Цит. no [4].

36. R. A. Ludwi g. Studies on the physiology of hadromycotic wilting in the tomato plant. McDonald College, McGill Univ., Montreal Techn. Bull.,

20. 1952. Цит. no [6].

37. G. A. Z e n t m e у e r, J. G. H о r s f a 11, P. P. W a 11 a g e. Dutch elm disease and its chemotherapy. — Connecticut. Agric. Exper. Sta. Bull.,

26. 1946.

38. P. E. Waggoner, A. E. D i m о n d. Examination of the possibility of therapy of plant disease with ionizing radiation. — Phytopathology,

42. 1952

39. S. S. G о t о s к a r, R. P. Scheffer, J. C. Walker, M. A. Stahmann. The role of pectic enzymes in Fusarium wilt of tomato. — Phytopathology,

43. 1953

40. S. S. Gotoskar, R. P. S с h e f f e r, J. C. Walker, M. A. Stahmann. The role of pectic enzymes in the development of Fusarium wilt in tomato. — Phytopathology, 45, 1955.
41. N. N. Winstead, J. C. Walker. Production of vascular browning by metabolites from several pathogens. — Phytopathology, 44, 1954.
42. P. E. Waggoner, A. E. D i m о n d. Pectic enzymes produced by Fusarium oxysporum f. lycopersici in infected plants. (Abstr.). — Phytopathology, 44, 1954.
43. R. P. S с h e f f e r, J. C. Walker. The physiology of Fusarium wilt of tomato. — Phytopathology, 43, 1953.
44. D. E. D e e s e, C. Stahmann. Formation of pectic enzymes by Verti- cillium Alboatrum on susceptible and resistant tomato stem tissues and on wheat bran. — Phytopathol. Z., 46, 1947.
45. D. F. Bateman. Pectolytic activities of culture filtrates of rhisoctonia solani and extracts of rhizoctonia-infected tissues of bean. — Phytopathology, 53, 1963.
46. W. C. Hall. Studies on the origin of ethylene from plant tissues. — Bot. Gaz., 113, 1951.
47. A. Ilusain, А. К e 1 m a n. The role of pectic and cellulolytic enzymes in the pathogenesis of Pseudomonas solanacearum. — Phytopathology, 48, 1955.
48. A. Husain, A. E. D i m о n d. Role of cellulolytic enzymes in pathogenesis by Fusarium oxysporium f. lycopersici. — Phytopathology, 50, 1960.
49. E. K. S. W о о d. Pectic and cellulolytic enzymes in plant disease. — Annual Rev. Plant Physiol., 11, 1960.
50. N. N. Winstead, C. L. McCombs. Production of pectinolytic and cellulolytic enzymes by Cucurbit Anthracnose fungi. — Phytopathology, 53,

1963.

51. D. H. S p a 1 d i n g. Production of pectinolytic and cellulolytic enzymes by Rhizopus stolonifer. — Phytopathology, 53, 1963.
52. K. C. A x в л e д и a h и. Метод обнаружения токсинов возбудителя мальсекко, болезни усыхания лимонных деревьев. — Сообщ. Академии с.-х. наук Грузинской ССР, 1, № 1, 1958.
53. К. С. Ахвледиани. Выделение токсинов гриба Phoma tracheiphila — возбудителя болезни усыханпя лимонов. — Сообщ. Академии с.-х. наук Грузинской ССР, 1, № 2, 1958.
54. К. С. А х в л е д и а н и. Хроматографирование мальсеккотоксина А. — Сообщ. АН Грузинской ССР, 26, 1961.
55. К. С. Ах в л е д н а н и. Выделение токсического вещества из древесины лимонов, пораженных мальсекко. — Сообщ. АН Грузинской ССР, 21, 1958.

О. Л. ОЗЕРЕЦ КОВС К Aff, Л. В. МЕТЛПЦКШЙ

Институт биохимии им. А. Н. Баха АН СССР