ТОКСИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА И ФЕРМЕНТЫ PHYTOPHTHORA INFEST ANS

О. Н. САВЕЛЬЕВА, Н. И. ВАСЮ КОВ А

Институт биохимии им. А. Н. Баха АН СССР

Изучение биохимической природы и физиологического действия токсинов является одной из основных задач иммунитета растений.

Мы ставили своей задачей изучить токсины грнба Phytophthora infestans.

Предыдущими нашими исследованиями на одной расе гриба [1—4] было установлено, что белково-липоидно-полисахаридный комплекс (БЛПК), выделенный из мицелия Ph. infestans, может быть разделен мягким гидролизом на составные части: белковую, липоидную и полисахаридную. Последняя составляет свыше 80%.

Из культуральной среды после роста на ней гриба в течение 4—6 недель был выделен полисахарид. Полисахариды БЛПК и культуральной среды электрофоретически делились каждый на три компонента. Все выделенные нами препараты и культуральная среда в целом оказались физиологически активными веществами и обнаружили токсическое действие по отношению к тканям листьев и клубней картофеля. Эти вещества вызывали на листьях картофеля образование некротических пятен — повреждений, сходных с симптомами заболевания фитофторозом.

На листьях устойчивых сортов некротические пятна всегда появлялись раньше и в большем количестве, чем на листьях восприимчивых. В этом случае проявляется реакция сверхчувствительности тканей устойчивых сортов картофеля к токсину паразита.

По Гойману [5], одним из показателей действия токсина является необратимое увядание растений. Выделенные же нами полисахариды как из мицелия грнба Ph.

Гис. J. Действие токсических веществ Ph. infestans на клубни устойчивого сорта картофеля

1 — раствор БЛЛК; 2 — раствор полисахарида БЛПК; 3 — раствор полисахарида культуральной среды; 4 — контроль (вода)

внем полисахаридов некроз возникал на зеленых тургорных листьях.

Водные растворы выделенных нами токсических веществ, введенные в ткани клубней картофеля при помощи шприцевых игл, вызывали образование строго локализованного некроза вокруг иглы у устойчивых сортов картофеля и размягчение ткани вокруг иглы у восприимчивых.

При повышенной влажности, т. е. в условиях, аналогичных тем, которые требуются для искусственного заражения клубней фитофторой, было проверено действие БЛПК и токсических ПО' лпсахарпдов на ткани клубней картофеля. Для этой цели на поверхность свеженарезанных ломтиков картофеля устойчивых и восприимчивых сортов были нанесены водные растворы испытуемых препаратов в концентрации 10 мг/мл. Через три дня на поверхности ломтиков устойчивых сортов (Московский, Любимец) появился некроз (рис. 1). Визуально он выглядел как при заражении устойчивого сорта картофеля грибом Ph. infestans. При снятии слоя некроза острым ланцетом оказалось, что он глубоко не проникает в ткани клубня. И это естественно, потому что только гифы гриба, содержащие токсические вещества, при проникновении их в ткани хозяина вызывают образование более глубокого некроза. На ломтиках восприимчивых сортов картофеля

Рис. 2. Действие токсического полисахарида, выделенного из мицелия гриба, на ткани клубней устойчивого и восприимчивого сортов картофеля 1 — устойчивый сорт (некроз); 2 — восприимчивый сорт (некроза нет)

(Северная роза, Приекульский) растворы полисахарида не вызывали некроза (рис. 2).

Многократное испытание действия токсических веществ на клубни картофеля показало, что некроз образуется только на тканях устойчивых сортов. Таким образом, устойчивость к поражению фитофторой коррелирует с образованием некроза под действием токсинов гриба.

Далее была исследована остаточная токсичность водных растворов после удаления полисахаридов. Оказалось, что последние полностью осаждались 10-кратным объемом спирта. Полученные таким образом водные растворы были нетоксичны по отношению к листьям картофеля.

Проведенные опыты показали, что токсическое начало как самого гриба Рк. т{ев1а,П8, так и культуральной среды, в которую гриб в процессе жизнедеятельности выделяет токсин, сосредоточено главным образом в полисахаридной фракции. Наши данные о токсичности культуральной среды после роста на ней Рк. infestan,^: были несколько позже подтверждены исследованиями Хельги Зайдель [6], которая констатировала наличие токсичности как в культуральной среде после 4—5-недельного роста гриба, так и в осадке, полученном при осаждении среды спиртом. Этот осадок соответствует выделенной нами полисахаридной фракции из культуральной среды.

Известно, что некроз, возникающий при взаимодействии паразита и устойчивого хозяина, препятствует дальнейшему распространению паразита. Было интересно посмотреть, как же действуют вещества, образующиеся при этом взаимодействии, на рост фитофторы. Для этой цели намп были приготовлены водные вытяжки из лиофилизованного некроза клубней устойчивого сорта (Любимец). Настой из 3 г в 60 мл воды пропускали через фильтр Зейтца. Перед искусственным заражением грибом Рк. т-

festans на поверхность овсяно-агаровой среды вносили вытяжку из некроза по 1 мл. В контрольные пробирки вносили воду. Оказалось, что продукты, возникающие при контакте паразита и хозяина, токсичны для гриба и подавляют сто рост (рис. 3).

Работа по изучению токсинов фитофторы была продолжена на двух расах: агрессивной 1 и менее агрессивной 0. Гриб выращивали в матрацах на синтетической среде Хэла. Состав среды следующий (в граммах): КН2РО4 — 0,05, М?в04 • 7НгО — 0,025, глюкоза — 2,5, аспарагин — 0,05, Са(Ж)3)2 — 0,07, тиамин — 0,0002, ГеЭ04 • 7ШО — 0,001, рибофлавин — 0,0002, вода — до 100 мл. Подобный способ выращивания дает возможность получать значительные количества мицелия гриба.

Токсические полисахариды фитофторы рас 1 и 0 выделяли из мицелия гриба и из культуральной среды методами, описанными в предыдущих сообщениях [1, 4].

Для испытания на токсичность по отношению к листьям картофеля выделенные препараты брали в концентрациях Ю0\/.ил воды, т. е. в значительно более низких, чем те, которые употребляли в прежних работах. Это давало возможность проследить разницу в действии токсинов различных рас фитофторы. Токсические полисахариды в концентрации 100 у/мл воды всегда вызывали образование некротических пятен на зеленых, тургорных листьях, погруженных черешками в эти растворы.

Однако начало появления пятен было различно во времени. Опыты по действию токсических полисахаридов на ткани листьев картофеля устойчивых и восприимчивых к фитофторе сортов повторялись многократно. Спустя 16—18 час. от начала опыта некротические пятна прежде всего появлялись на листьях устойчивого сорта, погруженных черешками в раствор полисахарида из культуральной среды агрессивной расы 1, затем через 3—5 час. — на листьях, погруженных в раствор полисахарида мицелия расы 1. Почти одновременно с последними некроз появлялся на листьях, погруженных в раствор полисахарида культуральной среды расы 0, и спустя 3—

5 час. — на листьях, погруженных

в раствор полисахарида мицелия расы 0. На листьях восприимчивого сорта некроз появлялся только через 24 час. от начала появления некроза на листьях устойчивого сорта. Образование некротических пятен на восприимчивом сорте шло в той же последовательности, как и на листьях устойчивого сорта. Вначале появлялись некротические пятна на листьях, погруженных в раствор полисахарида культуральной среды расы 1, затем в раствор полисахарида мицелия расы 1, полисахарида культуральной среды расы 0 и полисахарида мицелия расы 0. Данные, полученные на различных расах фитофторы, подтвердили наши прежние исследования полисахаридов одной расы гриба, также вызывающих реакцию сверхчувствительности, свойственную тканям устойчивых сортов.

Присуща ли подобная токсичность другим растительным полисахаридам?

Листья картофеля устойчивого и восприимчивого сортов, погруженные в растворы полисахаридов инулина и эремурана \ взятых в той же концентрации, не покрывались некротическими пятнами и, как контрольные листья, погруженные в воду, оставались тургорными и зелеными в продолжение всего опыта. Таким образом была подтверждена токсичность полисахаридов фитофторы по отношению к листьям картофельного растения.

Следующим этапом работы было исследование самих токсических полисахаридов. Было проведено измерение максимумов поглощения водных растворов полисахаридов на спектрофотометре в ультрафиолете. Оказалось, что максимум поглощения их лежит за пределами длины волны 220 ммк. По-видимому, выде-

1 Эремуран был любезно предоставлен Е. М. Афанасьевой.

Качественный состав сахаров, входящих в токсические полисахариды

лепные нами препараты полисахаридов не связаны с белком. По данным Розенфельд и Плышевской [7], комплекс полисахарида с белком характеризуется одним и тем же максимумом поглощения при 265 ммк независимо от природы углеводного и белкового компонентов. Качественные пробы на белок (реакция с нингидрином, биуретовая, ксантопротеиновая) были отрицательны. Редуцирующая способность полисахаридов при кислотном гидролизе всегда возрастала: у полисахаридов из мицелия от 3,6 до 80—87% и у полисахаридов из культуральной среды от 2,0-6,0 до 20-35%.

Гидролиз полисахаридов проводили в течение 3 час. с 1 п. НС] в кипящей водяной бане. Семичасовой гидролиз, используемый нами ранее с 1 н. НС1, приводил к реверсии глюкозы, в результате чего возникали дисахара. Гидролизаты полисахаридов исследовали хроматографией на бумаге. В качестве растворителей применяли: бутанол—уксусная кислота—вода (4:1:5) и ацетон — бутанол — вода (7:2:1) и проявляли соответственно анилингидрофталатом и азотнокислым серебром в щелочном растворе. По составу сахаров полисахариды рас 1 и 0 не отличались (табл. 1). При их исследовании обнаружены по четыре неиденти- фицированных пятна, лежащих выше положения уроновых кислот, галактоза, глюкоза, манноза, арабиноза, ксилоза, рибоза и рамноза. Различие обнаружено между полисахаридами из

3. Биохимические основы защиты растений

Рис. 4. Кривая фотометрирования электрофореграммы водорастворимого белка мицелия гриба Рк. Ьп/езЬапв, раса 4 (стрелки указывают на отдельные компоненты белка)

мицелия и из культуральной среды. Как уже указывалось выше, полисахариды мицелия отличаются от полисахаридов культуральной среды отсутствием в их составе аминосахаров и меньшим содержанием рибозы и рамнозы.

Трудно было предположить, что только полисахариды гриба обладают токсическим действием на ткани картофельного растения. Литературные данные указывают на ряд веществ как простых, так и целых комплексов, обладающих свойствами токсинов, которыми располагают патогенные микроорганизмы [8]. Многочисленные исследования в этой области показали, что действие патогенных микроорганизмов обусловлено не одним каким-либо компонентом, а одновременным действием нескольких токсических веществ. Гойман и сотрудники [9 —11], тщательно изучив токсин увядания томатов, обнаружили три вещества (ликомараз- мин, фузариновую кислоту и вазинфускарин). Поэтому представляло интерес испытать токсичность белков, выделяемых паразитом. Однако осуществить это методически нелегко, так как в культуральной среде белки гриба содержатся в таком ничтожном количестве, что практически извлечь их в нативном состоянии пока невозможно.

В последнее время нами были выделены нативные водорас-

Рис. 5. Действие белков, выделенных из мицелия различных рас фитофторы, на листья устойчивого сорта картофеля
1 — контроль (вода); 2 — белок из мицелия расы 0; з — то же расы 1; 4 — то же расы 4

творимые белки (альбумины) из мицелия трех рас фитофторы

О,              1 и 4. Полученные белковые препараты обладали электрофоретической подвижностью; в полиакриламидном геле делились на 6—8 компонентов (рис. 4).

Подобно токсическим полисахаридам, белковыо препараты из мицелия гриба (в той же концентрации 100 у/мл) вызывали образование некроза через 15—20 час. на листьях устойчивого сорта (рис. 5) и только через 40—60 час. на листьях восприимчивого. Как и в случае токсических полисахаридов, листья устойчивого сорта реагировали всегда значительно раньше на поступление токсических белков в их ткани. В данном случае также проявлялась реакция сверхчувствительности тканей устойчивого сорта к токсину паразита.

Далео было испытано действие белковых препаратов из тканей клубней, пораженных фитофторой. Был взят сорт Любимец, инфицированный расой 1. Белковые препараты, выделенные из пораженных тканей, оказались также токсичными для листьев картофеля. Следует отметить, что в данном случае токсическое действие было несколько слабее, чем в случае белков мицелия гриба. На листьях устойчивого сорта, погруженных черешками в водный раствор белкового препарата из тканей, пораженных фитофторой, слабый некроз появился спустя 21 час, а на листьях восприимчивого сорта только через 66 час. Важно отметить, что листья картофеля, хотя слегка желтели, но оставались тургор- ными. Более замедленная реакция листьев картофеля на белковые препараты из пораженных тканей вполне естественна, так как в этом случае мы имеем дело с токсинами гриба, которые но могли быть полностью изолированы при выделении белкового препарата и присутствовали в незначительном количестве.

На тканях клубней картофеля устойчивого сорта белковые препараты мицелия, как и в случае токсических полисахаридов, вызывали образование некроза (рис. 6).

Чтобы выяснить, только ли белки паразита обладают токсичностью, мы проверили водорастворимые белковые препараты из здоровых тканей картофеля, раневой перидермы, а также белки других видов растений. Оказалось, что белковые препараты четырех сортов картофеля (Олев, Любимец, Лорх и Северная Роза), два белковых препарата, выделенные из раневой перидермы сорта Любимец и сорта Лорх, и белки из пшеницы и сои не оказывали токсического действия на листья картофеля (рис. 7, 8). Следовательно, только белки паразита обладают свойствами токсинов.

Следующей задачей предстояло выяснить специфичность токсинов фитофторы.

Для этой цели было проведено сравнение действий токсинов фитофторы и химических ядов. В качестве ядов были взяты:

4. динитрофенол — классический разобщитель процессов окисле-

Рис. С. Действие белков, выделенных из мицелия различных рас фитофторы, на ткани клубня устойчивого сорта 1 — раса I: 2 — раса 4; з — раса 0; 4 — контроль (вода)

кия и фосфорилирования, азид натрия — разобщитель и ингибитор металлсодержащих ферментов и сулема, в концентрации 100 у/мл. При действии этих веществ одновременно на листья устойчивого и восприимчивого сортов картофеля образовался некроз через 16 час. от начала опыта. Однако характер некротических пятен был различный. Сулема вызывала образование точечного некроза. Влияние 2,4-динитрофенола и азида натрия было сильнее и визуально по характеру расположения и величине пятен сходно с действием токсинов фитофторы. Возможно, что механизм действия биологических ядов и токсинов паразита в какой-то степени сходен. Одновременное появление некроза на листьях устойчивых и восприимчивых сортов под влиянием ядов подтверждает специфичность действия токсинов фитофторы.

Кроме химических ядов, было интересно проверить действие веществ, выделяемых другими патогенами. Для этого была испытана токсичность культуральной среды после роста на ней фузариума. Культуральная среда этого гриба, разбавленная в два и пять раз, также одновременно вызывала некроз на листьях устойчивого и восприимчивого сортов. Некроз значительно отличался от некроза под действием токсинов фитофторы: некротические пятна располагались между основными жилками листа, создавая впечатление полосатости.

Исследование ферментативного аппарата Рк. т/е$1апamp; мы начали с изучения пектолптических ферментов. Эти ферменты играют важную роль при нападении паразита на ткани хозяина. Пектолитические ферменты мацерируют ткани растения и делают их доступными для проникновения паразита. Нами впервые у двух рас фитофторы 1 и 0 было обнаружено наличие пектоли- тических ферментов. Их активность определялась в двухнедсль-

ной культуральной среде и учитывалась по снижению вязкости, повышению кислотности и расщеплению пектина. Ниже приводятся данные по активности пектолитических ферментов двух рас фитофторы (на 1 мг сырого мицелия).

Раса 0              Раса 1

Вязкость

отн. ед                            5,52              8,85

%                            100              160

Кислотность

мл 0,1 н. ХаОН                            1,9              2,8

%                            100              147

Расщепление пектина

мг галактозы                            0,33              0,58

%              •                            100              170

Таким образом, расы фитофторы, различные по агрессивности, значительно отличаются и по активности пектолитических ферментов. Активность их у расы 1 в полтора и более раза выше, чем у расы 0.

Полученные нами данные по ферментам коррелируют с данными по токсинам. Раса 1 характеризуется более сильными токсинами и повышенной активностью пектолитических ферментов по сравнению с расой 0.

Интересно было изучить активность пектолитических ферментов при взаимодействии паразита с растением-хозяином. Для этого ломтики картофеля (сорт Любимец) заражали двумя расами фитофторы 0 и 1. Раса 0 вызывала образование некроза, раса 1 давала нормальный рост мицелия. Кроме того, брали ломтики без заражения для получения раневой перидермы; контролем служила ткань здорового свеженарезанного картофеля. Исследования активности ферментов проводили на пятый день после заражения. Активность пектолитических ферментов в тканях здорового картофеля, разрезанного п зараженного фитофторой, приведена ниже.

Падение              %

Ткань              вязкости,              к контро-

сск.              лю

Здоровая (контроль)                            16,7              100

Раневая перидерма                            13,5              81,8

Подраневая                            14,0              84,8

Некротическая (заражение расой 0)              25,0              151,5

Поднекротическая                             11,0              66,6

Загнившая (заражение расой 1) . .              32,5              196,9

Подлежащая                            20,5              124,0

Приведенные данные показывают, что зараженные ткани обладают значительно более высокой активностью пектолитических ферментов. Активность их в контрольной, раневой перидерме и подраневой тканях остается в пределах нормы. В некротической ткани, т. е. тканн, пораженной нулевой расой, активность этих

Рис. 7. Действие белков здорового картофеля (1), белков раневой перидермы (2) и белков мицелия гриба (3) на листья картофеля

Рис. 8. Действие белков из пшеницы (1), сои (2) и из мицелия гриба

на листья картофеля

ферментов заметно ниже, чем в загнившей, зараженной расой I. Очевидно, фенольные соединения пли какие-то иные вещества, присутствующие в ткани некроза, обладают способностью связывать экзоферменты паразита. Это особенно хорошо видно в под- некротической ткани. Если в подлежащей ткани, зараженной расой 1, активность ферментов еще достаточно высока (124,0%), то в поднекротической ткани она становится значительно ниже контроля (66,6%).

Изучение токсических веществ и ферментативного аппарата гриба позволит найти приемы их блокирования, и это будет служить одним из способов защиты растений.

ВЫВОДЫ

1. У гриба Ph. infestans были обнаружены два соединения, обладающие свойствами токсинов: полисахариды, выделенные из белково-липоидно-полисахаридного комплекса и из культуральной среды, и белки, извлеченные из мицелия гриба.
2. Токсичность проявляется в образовании некротических пятен на тканях листьев и клубней картофеля.
3. Испытание токсинов в малых концентрациях выявило наиболее отчетливо специфичность их действия на листья устойчивого и восприимчивого сортов картофеля.
4. Полисахарид из культуральной среды токсичнее полисахарида, выделенного из мицелия. Методами хроматографии и инфракрасной спектроскопии в его составе удалось обнаружить присутствие ацетилированных аминосахаров.
5. Полисахариды, выделенные из агрессивной расы 1, оказались более токсичными для листьев картофеля, чем полисахариды, свойственные расе 0.
6. Обнаружена корреляция между токсинами и активностью пектолитических ферментов. Раса 1 характеризуется более сильными токсинами и повышенной активностью пектолитических ферментов по сравнению с расой 0.

ЛИТЕРАТУРА

1. О. II. Савельева. К биохимии гриба Phytophthora infestans. Доклад на конференции по научным проблемам защиты растений. Будапешт,

1960.

2. О. Н. Савельева. Б. А. Руб ни. К биохимии гриба Phytophthora infestans. — Докл. АН СССР. 137, № 4, 1961.
3. О. Н. Савельева, Б. А. Руби и. К биохимии взаимодействия гриба Phytophthora infestans и картофеля. — В сб.: «Биохимия плодов и овощей», № 7. М., Изд-во АН СССР, 1962.
4. О. Н. Савельева, Б. А. Руби н. К вопросу о природе и физиологической активности токсина гриба Phytophthora infestans. — Физиология растений, 10, вып. 2, 1963.
5. Э. Г о й м а и. Инфекционные болезни растений. М., ИЛ, 1954.

0. H. Saidel. Untersuchungen uber den Nahrstoff bedarf und die Toxinbildung des Pilzes Phytophthora infestans (Mont) de Bary in vollsynthetischen Nahrlosungen. — Phytopathol. Z.. 41. II. 1. 1961.

7. E. JI. Розенфсльд, E. Г. Плышевская. Влияние структуры различных полисахаридов растительного тт животного происхождения на их способность образовывать комплекты с белками. — Биохимия,

19. вып. 2, 1954.

8. Б. А. Рубин, Е. В. А р ц и х о в с к а я. Биохимия и физиология иммунитета растений. М., Изд-во АН СССР, 1960.
9. E. Gaumann, S. Naef-Roth, G. М i е s с h е r. Untersuchungen uber das Lycomarasmin. — Phytopathol. Z., 16, H. 3, 1950.
10. E. Gauman n. Uber Fusarinsaure als Welketoxin. — Phytopathol. Z., 29,

2. 1. 1957.

11. E. Gaumann, Ch. S t о 11, H. Korn. Uber Vasinfuscarin ein dritter Welketoxin des Fusarium lycopersici Sacc. — Phytopathol. Z., 20, H 3, 1953.