Создание трансгенных растений, устойчивых к грибным болезням

Известен набор различных механизмов защиты растений от грибных патогенов: морфологические барьеры; локальная гибель инфицированных клеток; биосинтез ФА; синтез ферментов, разрушающих клеточные стенки патогена; синтез рибосоминактивирующих белков, и др.

Рассмотрим возможности использования различных генов хозяина или патогена, продукты экспрессии которых влияют на их взаимодействие, в создании трансгенных растений, устойчивых к грибным болезням. Устойчивость растений к грибным
патогенам как следствие экспрессии генов чужеродных фитоалескинов
Устойчивость растений к грибным фитопатогенам обусловлена множеством защитных механизмов как конститутивной так и индуцированной природы. Одним из наиболее значимых инструментов защиты считается индуцибельный синтез растением ФА (ФА) — низкомолекулярных вторич
ных антимикробных соединений (подробнее см. главу 5). Преимущество 487 такого механизма защиты заключается в том, что синтез ФА начинается быстро в ответ на внедрение патогена в ткани растения-хозяина, стресс или обработку рядом природных и синтетических соединений. Изучены гены, контролирующие биосинтез ряда ФА. Методами генной инженерии был осуществлен перенос этих генов в растения-реципиенты, относящиеся к другому виду, роду или даже семейству, что позволило продемонстрировать роль ФА в защитных реакциях растений, для которых встроенные гены являются чужеродными. Наряду с важным теоретическим значением эти опыты по трансформации представляют интерес и с точки зрения их практического применения, поскольку их результаты открывают возможность использования генно-инженерных технологий для создания трансгенных сортов сельскохозяйственных культур, устойчивость которых к грибным фитопатогенам будет обусловлена экспрессией генов чужеродных высокоэффективных ФА. В данном разделе будут рассмотрены результаты наиболее интересных экспериментов в этой области.
Роль ФА в устойчивости к болезни
Способность синтезировать фитоалексины, в ответ на заражение грибными фитопатогенами, показана для растений, относящихся к различным таксономическим группам, включая семейства Leguminosae, Solanaceae, Vitaceae и т. д. В ряде случаев, была найдена положительная корреляция между синтезом ФА и устойчивостью к болезни.
Большинство ФА — фенилпропаноиды, преимущественно изофлаво- ноиды и стильбеноиды, терпеноиды или ацетилены (подробнее см. главу 5). Первым фитоалексином, который был выделен из инфицированных грибом стручков гороха и охарактеризован биохимически является пизатин.
Фермент пизатиндиметилаза (pda) из патогена гороха Nectria baemato- сосса {Fusarium solani f. sp. phaseoli) способен нейтрализовать фунгиток- сичность фитоалексина пизатина, который синтезируется в растениях гороха в ответ на инфекцию. Гены, кодирующие pda, были перенесены в геном Cochliobolus heterostrophus, грибного патогена кукурузы, не способного заражать горох. Трансгенный С. heterostrophus оказался вирулентым как по отношению к кукурузе, так и к гороху, подтверждая концепцию о том, что устойчивость патогена к фитоалексину может определять его вирулентные свойства. Этот же патоген индуцирует синтез фитоалексина маакиаина при инфицировании турецкого гороха. Синтез детоксицирующего фтоалексин фермента контролируется геном N. baematococca Makl.
Киевитонгидратаза — другой хорошо изученный фермент, продуцируемый Fusarium solani f. sp. phaseoli. Этот грибной фермент способен детоксицировать основной изофлавоноидный фитоалексин, который синтезируется растением-хозяином Phaseolus vulgaris (французские бобы), катализируя превращение киевитона в менее фунгитоксичный гидрат киевитона.
И в данном случае способность гриба дезактивировать киевитон определяет вирулентность этого фитопатогена.

Другой фитоалексин-деградирующий фермент, фазеоллидингидрата- за, выделен из F. solani J sp .phaseoli и охарактеризован. Этот фермент детоксицирует изофлаваноид фазеоллидин — фитоалексин, который продуцируется французскими бобами, путем его гидратации. Фитопатогенный гриб Botrytis cinerea способен нейтрализовать токсичность ФА оксистиль- беновой природы (в том числе ресвератрола и птеростильбена) с помощью фермента оксидазы стильбена.
Так как способность патогена снижать токсичность, по крайней мере, некоторых ФА может определять спектр хозяев этого патогена, то одной из возможных задач будущих биотехнологических исследований в этой области могло бы быть выделение и перенос генов, участвующих в модификации ФА. Новые модифицированные соединения должны быть менее чувствительны к детоксицирующим ферментам грибных патогенов при сохранении своих защитных свойств.
Экспрессия чужеродных ФА в растениях
Гены из арахиса и винограда, кодирующие стильбенсинтетазу (STS), которая отвечает за синтез стильбен-подобного фитоалексина ресвератрола при переносе в геном растений табака экспрессируют ресвератрол в ответ на заражение грибным патогеном. STS — ключевой фермент, участвующий в образовании стильбена при превращении одной молекулы р-кумарол-СоА и трех молекул малонил-СоА в 3,4,5-тригидроксистильбен (ресвератрол). Эти данные свидетельствуют о принципиальной возможности экспрессии фитоалексина ресвератрола в чужеродном растении-хозяине, однако уровень экспрессии STS-гена в табаке невысок.
После обработки препаратом элиситора из Phytophthora megasperma конечное количество STS тРНК, аккумулированное в каллусах трансгенных Табаков, достигает только около 0.5 % от количества STS тРНК, накапливающейся в гомологичной системе — каллусе ореха. Причиной этого могло быть наличие в норме, по крайней мере, 6 или 8 различных STS генов в клетках ореха (также как и в клетках виноградной лозы), тогда как в описываемых экспериментах использовался только один STS ген. Фитопатологические тесты в теплице с трансгенным табаком, содержащим ген земляного ореха, показали относительно более высокую устойчивость к заражению Р megasperma у трансгена.
Повысить уровень экспрессии STS-генов удалось путем переноса в растения табака двух STS генов винограда. При этом синтез STS m-РНК в каллусах табака достигает 5-10 % от количества индуцированного элиситором синтеза STS m-РНК в каллусах винограда. Как и в случае с виноградом синтез STS в трансгенном табаке также оказался индуцибельным.

Полученные трансгенные табаки, наряду с продуцированием больших количеств фитоалексина ресвератрола, проявляли высокую степень устойчивости к Botrytis cinerea. Уровень подавления развития болезни колебался в пределах от 52 до 82 % по сравнению с исходным нетрансгенным табаком.

Повышение устойчивости к Phytophthora infestans и Fusarium sulfureum 489 было продемонстрировано в экспериментах с трансгенными растениями томатов и картофеля, экспрессирующих два STS гена виноградной лозы.
Анализируя описываемые экспериментальные данные, следует подчеркнуть весьма принципиальный момент. Для повышения устойчивости к болезням определенный патоген должен индуцировать биосинтез ФА в растении-хозяине. Молекулярный анализ экспрессии STS генов показал, что она может быть индуцирована в гетерологичном растении, по крайней мере, некротрофными грибами. Так, Botrytis cinerea или Alternaria longipes способны включать синтез ресвератрола в табаке. С точки зрения практической агрономии было бы важно выяснить, может ли биосинтез чужеродных ФА индуцироваться и биотрофными грибными патогенами, (такими как Erysiphe graminis, Bremia lactuca, Plasmopara viticola и Puccinia spp.) в соответствующих растениях-хозяевах. Результаты экспериментов, проведенных на паре «патоген — хозяин» Plasmopara. viticola — Vitis vinifera, показали положительную корреляцию между индуцированным синтезом фитоалексина и устойчивостью растения-хозяина. Это очень важное обстоятельство позволяет надеяться на реальное использование описанных подходов для получения хозяйственно значимых источников устойчивости и дальнейшего их использования в селекционной работе.
Одним из перспективных направлений поиска путей к повышению устойчивости растений к грибным болезням методами генной инженерии является детальное изучение механизмов регуляции и индукции неких ключевых генов, имеющих отношение к биосинтезу ФА. Например, кас- бенсинтетаза из клещевины — конечный фермент, участвующий в цепи биосинтеза, приводящего к образованию дитерпеноидного ФА касбена. Синтез касбенсинтетазы индуцируется в растительных тканях в ответ на заражение грибами, обработке грибным белком или другими элиситорами.
В настоящее время клонирована кДНК этого фермента, что открывает путь к созданию трансгенных растений с индуцируемой устойчивостью к грибным болезням. В связи с тем, что касбенсинтетаза катализирует только одну, уникальную в цепи биосинтеза касбена, завершающую стадию — перенос гена касбенсинтетазы в другие растения помог бы определить ролькасбена в механизмах защиты от грибных патогенов.
Другим возможным подходом к повышению устойчивости растений к грибным патогенам могло бы быть включение в геном растений генов, продукты которых способны модифицировать структуру ФА, делая их либо более фунгитоксичными, либо более устойчивыми к действию грибных детоксикантов. Так, например, известно, что разные грибные патогены гороха обладают разной чувствительностью по отношению к (+) или (-) стереоизомерам фитоалексина пизатина (см. главу 5). Кроме того, эти изомеры различаются по чувствительности к деградирующим ферментам и другим метаболитам одного и того же патогена. Существуют ферменты изомеразы (в данном случае — изофлавоноксидоредуктаза), которые могли бы быть использованы для преимущественного синтеза (+) или (-) стереоизомера

490 фитоалексина пизатина в зависимости от того, к какому патогену необходимо повысить устойчивость растения-хозяина. В настоящее время фермент изофлавон оксидоредуктаза, а также клонирован ген, ответственный за синтез этого фермента. Реализация этого подхода могла бы быть примером получения трансгенных растений с искусственно повышенной активностью ФА, защищенных от деградирующих факторов грибных патогенов.
Существуют и другие пути повышения фунгитоксичности ФА. Так, известно, что фунгитоксичные свойства стильбенов связаны с гидрофоб- ностью этих соединений. Поэтому повышение их биологической активности возможно путем, например, метилирования. В этой связи перенос генов, кодирующие ферменты, подобные ресвератрол-метилтрансферазе или пиносилвинмонометилтрансферазе, в новые растения-хозяева может приводить к образованию более токсичных для грибов, соответственно, монометиловых эфиров птеростильбена или пиносилвина.
Пиносильвин синтетаза (PSS), стильбенсинтетаза из Pinus sylvestris, образует 3,5-дигидроксистильбен (пиносилвин), который более гидрофо- бен, чем ресвератрол. Выделен и клонирован ген PSS и был осуществлен перенос данного гена из сосны обыкновенной в растение табака. Экспрессия PSS проходила под контролем 35S РНК промотора и STS промотера из виноградной лозы. Активность этого фермента была обнаружена в свежевыделенных экстрактах тканей табака. Фитопатологические опыты в теплице показали повышение устойчивости этих трансгенных растений при заражении Botrytis cinerea. Приведенные данные открывают возможность синтезирования помимо ресвератрола, других чужеродных ФА, помимо ресавератрола, тем самым, увеличивая устойчивость к болезни и расширяя спектр антигрибной активности новых трансгенных растений.
Одним из возможных претендентов для таких исследований мог бы быть фермент бибензилсинтаза (BBS), который катализирует одну из ступеней в биосинтезе фенольного составляющего фенантреновых ФА. Эти фитоалексины продуцируются в тканях орхидеи Bletilla striata. Поскольку соответствующий этому ферменту ген выделен и отклонирован, т. е. возможность его переноса в другие виды растений с целью индуцирования в них синтеза чужеродных дигидрофенантреновых ФА.
Таким образом, использование новых эндогенных антимикробных соединений — одна из наиболее Многообещающих стратегий в молекулярной селекции растений на устойчивость к грибным патогенам. Основным ограничением этого подхода до сих пор является малое число доступных для таких экспериментов генов, ответственных за синтез ФА или их модификацию. По мере увеличения знаний о молекулярных механизмах взаимодействия между грибом и растением будут возрастать возможности применения описанных биотехнологических подходов и методов в сельскохозяйственной практике.

<< | >>

Источник: Под ред. Ю. Т. Дьякова. Фундаментальная фитопатология. 2011

Еще по теме Создание трансгенных растений, устойчивых к грибным болезням:

- Агрохимия и агропочвоведение - Животноводство и промыслы - Защита растений - Земледелие - Овощеводство - Плодоводство - Пчеловодство - Растениеводство - Сад и огород - Селекция и семеноводство с/х культур - Сельскохозяйственные мелиорации -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -