ЧУМА СВИНЕЙ

Schweinepest (нем.); Pestes Porcine (франц.); Peste Porcina (исп.)

Чума свиней (классическая чума свиней, КЧС) - высоконтагиозная инфекционная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, поражением кровеносной и кроветворной систем, крупозным воспалением легких и крупозно-дифтерическим воспалением толстого кишечника.

Клинические признаки и патологоанатомические изменения. Инкубационный период в зависимости от вирулентности вируса и чувствительности животных длится 3-9 дн, реже - 12, иногда - до 20 дн (20, 21, 22, 23). КЧС может протекать сверхостро, остро, подостро и хронически. Некоторые исследователи выделяют особую нервную форму, когда доминирующий симптом болезни - поражение ЦНС. Сверхострое течение болезни наблюдается очень редко и у молодых животных. Оно характеризуется быстрым течением, высокой температурой (41-42°С), угнетенным состоянием, апатией, полным отсутствием аппетита и рвотой, учащенным сердцебиением и дыханием, ярко-красными пятнами на коже.

Нервная форма относится к острому течению болезни и характеризуется судорожным подергиванием отдельных групп мышц, манежными движениями, параличами задних ко- нечностаей, нервным возбуждением и апатией, сонливостью. Температура - в пределах нормы или повышена до 40,5-41°С. Смерть наступает довольно быстро - через 24-48 ч.

Подострое течение наблюдается нередко после острого течения, болезнь затягивается до 3 нед. Температура тела при подостром течении несколько ниже, чем при остром. Выздоровление отмечается редко. При затяжном течении чумы наблюдается наслоение вторичных бактериальных инфекций: сальмонеллеза и пастереллеза. В случае осложнения чумы сальмонеллезом местом локализации вторичных поражений является ЖКТ (кишечная форма чумы). Запор, характерный для острого течения чумы, сменяется изнурительным поносом со зловонным запахом и примесью слизи, а иногда крови.

При осложненении чумы пастереллезом поражения локализуются в органах дыхания (легочная форма). У животных наблюдают затрудненное дыхание, кашель, иногда удушье, признаки бронхопневмонии, слизисто-гнойные истечения из носа; температура тела выше 40°С. Болезнь чаще всего кончается гибелью животного, нередко наблюдают осложнение чумы сальмонеллезом и пастереллезом одновременно (смешанная форма). И в том и другом случае животные гнбнут.

Хроническое течение характеризуется продолжительным течением болезни (несколько недель и даже месяцев), тяжелым крупозно-дифтероидным поражением ЖКТ, гнойнофибринозным воспалением легких и плевритом. У больных животных наблюдают понижение илн потерю аппетита, конъюнктивит, понос, иногда сменяющийся запором, анемию и прогрессирующее исхудание; свиньи превращаются в заморышей. Голова и хвост у них опущены книзу, спина изогнута, заостренный зад отвисает, задние конечности подогнуты под живот. Животные большей частью лежат, зарывшись в подстилку. Температура тела повышена, но нередко повышение темпера туры отсутствует. Часто отмечаются некрозы кончиков ушей и хвоста. При хроническом течении появляются благоприятные условия для развития вторичных инфекций: сальмонеллеза и пастереллеза. Однако часто стало появляться субклиническое н хроническое течение, характеризующеся нарушением функции воспроизводства (бесплодие, аборты, мертворождаемость). Одной из причин, способствующих появлению этих форм, является размножение вирулентных штаммов в недостаточно иммунном организме, в частности, у привитых инактивированными вакцинами. Мертворождаемость, отставание в росте свидетельствуют о заражении плодов через плаценту. Конге- нитальная передача вируса может сопровождаться персистентной виремией в течение всей жизни животных или очень длительного периода. В первые недели жизни у поросят, родившихся с персистентной виремией, не находят никаких видимых признаков болезни, но такие животные передают вирус другим.

Патологоанатомические изменения. Патологоанатомические изменения (1) при КЧС очень вариабельны и зависят от течения болезни н наличия осложнений секундарной инфекцией (сальмонеллез, пастереллез и др.) Наиболее типичные изменения встречаются у подсвинков н взрослых животных. Острая (септическая) форма чумы протекает обычно без осложнения вторичной инфекцией. На краях век и в углах глаз образуются коричневые корочки. Конъюнктива, слизистые оболочки носа и рта, цианотичны. Кожа ушей, шеи, живо та, внутренней стороны бедер пятнисто или диффузно окрашены в багрово-красный цвет, видны точечно-пятнистые кровоизлияния. Обращает внимание выраженные явления геморрагического диатеза в различных органах. Наиболее характерные изменения в лимфоузлах, селезенке и почках. Лимфоузлы, преимущественно головы и шеи, набухшие, сочны, красного цвета снаружи и мраморного вида на разрезе. Селезенка обычных размеров или несколько уменьшена, часто (в 40-50% случаев) с инфарктами по краю органа. Почки обычно бледные, с многочисленными точечными кровоизлияниями в корковом слое. Геморрагии встречаются также в слизистой оболочке лоханки, мочеточников и мочевого пузыря. Надпо-

Таблица IV. 1. Общие признаки острой, хронической и латентной чумы свиней (Van Oirshot J.T. , 1994) Показатели Острая Хроническая Латентная Вир у лента ость вируса Высокая Умеренная Низкая Бремя заражения Постнатальное Постнатальное До рождения Течение Короткий инкубационный период, тяжелая депрессия, высокая лихорадка, анорексия, конъюнктивит, запор, диарея, конвульсии, нарушение координации, геморрагии на коже Короткий инкубационный не риод, три фазы заболевания: 1.

Депрессия, лихорадка, ано рексия; 2.

Клиническое улучшение; 3.

Коиечная фаза обострения заболевания Латентное заболевание, особенно тяжелая депрессия и анорексия, нормальная или слегка изменяющаяся темпе ратура тела, конъюнктивит, дерматиты, двигательные на рушения Виремия Высокого уровня Непостоянная Высокого уровня Лейкопени

я Развивается быстро Развивается быстро, следует за лейкоцитозом Развивается поздно в течение заболевания Иммунный ответ на КЧС Отсутствует Присутствует Отсутствует Наступ ле- ние смерти Через 10-20 дн Через 1-3 мес Через 2-11 мес Выраженн остъ поражении Множественные геморрагии, особенно в лимфоузлах и почках, инфаркты селезенки Изъязвления толстого кишечника /‘бутоны”, инфаркты селезенки Лимфоузлы увеличены, ти- мус атрофирован Патогис

тология Дегенерация эндотели- аль ных клеток, пролиферация ретикулярных клеток, энцефалит Дегенерация эндотелиальных клеток, тяжелое лимфоцитарное истоще ние, гистиоцитар- ная гиперплазия, громеруло нефриты Дегенерация эпителиальных клеток, тяжелое лимфоцитарное истоще ние, гистиоцитарная гиперплазия

чечники набухшие, полнокровны. В сердце и печени иногда регистрируют кровоизлияния. В желудке и кишечнике острое, катаральное, реже крупозно-геморрагическое воспаление слизистой оболочки с кровоизлияниями, гиперплазия лимфоидных (солитарных) фолликулов и пейеровых бляшек. Легкие полнокровны, иногда с очагами серозно-катаральной или крупозно-геморрагической пневмонии. Головной и спинной мозг и их оболочки отечны, полнокровны, местами с точечными кровоизлияниями (72, 77) (Рис. 47, 48, 128-134).

При чуме, осложненной пастереллезом (грудная форма), основные изменения наблюдают в органах грудной полости: крупозно-геморрагическую пневмонию, множественные некрозы, серозно-геморрагический или фибринозный плеврит и перикардит, интенсивные кровоизлияния на серозных покровах грудной полости, а также на слизистой гортани и трахеи. Кроме того, встречаются кровоизлияния в коже, в почках и в кишечнике, набухание и изъязвление фолликулов толстого кишечика.

Гистологические изменения при КЧС неспецифические. Большая часть процессов, на которых может базироваться гистологическая диагностика, очень легко распознается на вскрытии (геморрагический лимфоденит, инфаркты селезенки и др.) Определенную диагностическую ценность представляют лишь изменения кровеносных сосудов, преимущественно в легких, с которыми связано формирование ряда характерных для чумы патологических процессов в различных органах (лимфоузлах, селезенке, почках, ЦНС и др.). В лимфоузлах устанавливают полнокровие сосудов, гемогенизацию, фибриноидное набухание и некроз стенок сосудов, микронекрозы лимфоцитов, очаговые скопления плазмоцитов, чаще по ходу сосудов. В селезенке, в зоне инфаркта, отмечают некроз ткани, а вне зоны - кровоизлияния, очаги кариорексиса лимфоцитов и небольшие группы незрелых клеток лимфоидного ряда. В почках зернистая дистрофия и некроз канальцевого эпителия, гломерулонефрит и кровоизлияния в виде петехий и экхимозов во всех слоях, а также в слизистую лоханки мочевого пузыря. В большинстве случаев (70-90%) в ЦНС обнаруживают негнойный лимфоцитарный энцефаломиелит, характеризующийся наличием периваскулярных лимфоцитарных инфильтратов, очаговой пролиферации клеток микроглии (глиальных узелков) и дистрофии ганглиозных клеток.

Патогенез. При КЧС патогенез необходимо рассматривать в 2-х аспектах: на клеточном уровне и на уровне целого организма. Как установлено, тип взаимодействия вируса с клетками - персистентный, проникновение вируса в клетку - рецептор-зависимое. Несмотря на продуктивную инфекцию и образование инфекционного вируса, возбудитель не оказывает ЦПД на зараженную клетку и, следовательно, не ясен патогенетический механизм in vitro. Система мононуклеарных фагоцитов (СМФ) обеспечивает диссиминацию вируса в организме свиней. Вирусный патогенез на уровне целого организма представляется так: инфект (ВКЧС) - ворога инфекции (миндалины и носоглотка) - первичная виремия (16-24 ч после заражения) - максимальное накопление ВКЧС в органах иммунной системы (лимфоузлы, селезенка, костный мозг, пейеровы бляшки). На 4-6-е сут - вторичная инфекция. С 4-х сут после инфицирования - вирусовыделение с секретами и экскретами (1).

Патогенез КЧС можно рассматривать как вирус-индуцированное нарушение ферментных систем у больных животных (30, 72). В организме вирус размножается в лимфоцитах лимфоузлов, селезенки, костного мозга и эндотелии кровеносных сосудов, вызывая дистрофические и некротические изменения. Под влиянием вируса развиваются некротические изменения и основного вещества стенок кровеносных сосудов микроциркулярного русла различных органов в виде мукоидного и фибриноидного набухания и некроза, накопления кислых мукополисахаридов. В результате этого сильно повышается проницаемость стенок сосудов, что приводит к возникновению кровоизлияний, отеков, некродистрофических и воспалительных процессов в различных тканях и органах. Размножаясь в клетках иммунной системы и вызывая их разрушение, вирус сильно снижает защитные (иммунные) свойства организма, что способствует активации вторичной инфекции (пастерелл, сальмонелл) и отягощению основного процесса (1).

В патогенезе болезни основными факторами ее развития являются химотрипсин и другие субстанции нормальной ткани поджелудочной железы. Химотрипсин является одним из АГ, индуцированных вирусом, поэтому КЧС можно рассматривать как инфекцию, при которой происходит расстройство ферментных систем организма с повышенной продукцией химотрипсина (20)., Известно, что макрофаги (МФ) являются не только эффекторной клеткой иммунной системы, но и секреторной, обладающей значительным цитолитическим потенциалом (протеазы и свободные радикалы кислорода). Неспецифическая цитотоксичность МФ селезенки резко возрастает при персистенции вирусов в клетках (30). Ингибиция фагоцитарной функции и активация секреторной функции МФ под действием репродукции ВКЧС является характерным проявлением прямого ЦПД возбудителя как in vitro, так и in vivo. В то же время ВКЧС не оказывает прямого ЦПД на лимфоциты, так как все попытки показать in vitro тяжелые нарушения реактивности Т- и В-лимфоцитов имели отрицательный результат (78). Поэтому поражение клеток (некроз лимфоцитов) при КЧС является результатом непрямого действия вируса, и развивается в результате активации цитолитиче- ского потенциала зараженных клеток-мишеней (МФ) при непосредственным контакте с другими клетками (лимфоцитами, эпителиальными, эндотелиальными и др.). Кроме того, макроорганизм в отличие от культивируемых клеток имеет систему кровообращения. Следовательно, циркулярные нарушения кровообращения, вызванные непрямым вирусиндуциро- ванным поражением стенок сосудов и воспалительной реакцией, играют важную роль в патогенезе КЧС, вызывая отек, геморрагии, инфаркты.

Существуют 6 концепций патогенетического механизма при КЧС: 1) КЧС как иммунопатологический процесс циркулирования в крови комплексов АТ-АГ и их оседания на поверхности сосудов ; 2) КЧС как процесс нарушения коагуляционных механизмов крови ; 3) КЧС как сверхострый паралимфобластический лейкоз; 4) КЧС как процесс вирусиндуциро- ванного расстройства ферментных систем организма с гиперпродукцией химотрипсина ; 5) КЧС как процесс вирусиндуцированного поражения надпочечников с гиперпродукцией глюкокортикостероидов из гиперплазированной корковой зоны (78); 6) КЧС как процесс виру- синдуцированной активации клеток СМФ и(или) нейтрофилов с гиперпродукцией цитоток- синов-протеаз и свободных радикалов кислорода.

Клетки, зараженные ВКЧС, не несут или несут очень мало вирусного АГ на своей поверхности, поэтому инфицированные клетки могут избегать иммунной атаки клеток хозяина (78, 79). Имеется ряд интересных фактов, подтверждающих патогенетическое значение про- теаз - выраженнее болеют КЧС более упитанные животные, получающие богатый белками корм (опыты на крысах показали, что у них при таком режиме кормления усиливается образование протеаз). Установлены резкие возрастные колебания уровня химотрипсина в крови и соответствующие изменения уровня лимфоцитов. Одним из путей, приводящих к развитию поражений при КЧС, являются нарушения в системе свертывания крови, в частности развитие тромбоцитопении и изменение коагуляционных параметров. Вследствие максимальной активности коагуляционной системы развивается синдром диссиминированного внутрисосудистого свертывания крови, приводящий к появлению геморрагий. Одна из распространенных в настоящее время точек зрения состоит в том, что патологические процессы н летальный исход определяются разрушением В-лимфоцитов или В-лимфобластов в зародышевых центрах лимфоузлов (10а, 36а, 92а).

ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

Вирусную природу КЧС установили в 1908 г. Швейнитц и Дорсе.

Морфология и химический состав. Вирионы - оболочечные частицы (Рис. 16) диаметром 40-60 нм с нуклеокапсидом диаметром около 29 нм (61). В структуре ВКЧС обнаружено 3 гликопротеина с мол.м. 44, 33 и 55 кД (69). Белок El (51-56 кД) очевидно представляет собой гликопротеин оболочки вируса, содержит главные консервативные иммунодоме- нантные области, отвечающие за индукцию синтеза ВНА и протективный иммунитет. Белок El всегда находится в ассоциации с гликопротеином 31 кД в виде гетеродимера (85). Модель готового иммунодоминантного сайта ВКЧС выглядит следующим образом: 13 эпито пов формируют 4 АГ домена - А, В, С и Д. ВН-активностью обладали АТ против доменов

А, В и С (97).

Геном вируса - 1-нитевая РНК положительной полярности с размером в 12284 тыс. нуклеотидов. Единственная рамка считывания, вероятно, соответствует полипротеину с длиной 3898 аминокислотных остатков (12 kb) (58, 62), 4 структурным белкам (3 гликопротеида - VPI, VP2, VP3 и 1 капсидный белок -СР) и 3-7 неструктурным белкам (р125, р80, gp62, gp53, gp48, gp25 и gp20) (60, 61). Полагают, что VP1 и VP2 представляют собой оболочеч- ные белки. В составе геиома В КЧС неструктурные белки располагаются в следующем порядке (от N-конца к С-концу): gp44/48 - gp33 - gp55 (17, 36, 42). Плавучая плотность, в зависимости от градиента материала и клеток, обеспечивающих размножение вируса, составляет 1,12-1,17 г/см3. Коэффициент седиментации составляет 140-180S (49). На основании строения генома, состава белков и стратегии репродукции Collet M.S.et.al. (86) считают необоснованным относить пествирусы к семейству Togaviridae и предложили считать их отдельным родом семейства Flaviviridae. Геномная РНК этого вируса может быть использована в качестве исходного материала для получения кДНК и ее клонирования (69).

Разработана методика получения очищенного ВКЧС (И). В настоящее время дана полная характеристика его генома, определен порядок расположения генов структурных белков: 5'- р23 - р14 - gp44 - 48 - gp25 - 31-gp53 - 55 - 3'. Общая гомология между вирусами по нуклеотидной последовательности составляет 60%, по аминокислотной - 85%. Однако уровень перекрестной нейтрализации их довольно низкий. Более тонкие АГ-различия и сходства, а также детерминанты патогенности и нейтрализации, определены с помощью АТ (94).

Устойчивость. ВКЧС считается сравнительно малоустойчивым к высоким температурам. Сыворотка крови больных КЧС при 37°С содержит активный вирус в течение 11 дн. Полная его инактивация при такой температуре наступает через 18-20 сут. При 56°С вирус инактивируется через 60 мин, при кипячении - моментально. В свинарниках (полы, стены) не теряет вирулентности в течение года; низкие температуры его консервируют. Вирус, содержащийся в сыворотке крови больных свиней, хранившейся при температуре 2-4°С, не теряет активности 4-6 мес. В свиных тушах остается вирулентным после 2-6-мес хранения в холодильнике при температуре -20-25°С. Хорошо сохраняется в лиофилизированном состоянии при pH между 5 и 10. Быстро инактивируется под действием эфира, хлороформа и дезоксихолата, чувствителен к трипсину и липазам, MgCl2 не оказывает на него стабилизирующего действия. Лучшими дезинфицирующими средствами являются 2%-ный р-р NaOH, хлорная известь 1:20 и 3-6%-ное крезоловое масло.

ВКЧС сохраняет вирулентность и АГ-свойства в нативной и лиофилизированной крови при хранении в замороженном состоянии длительное время - 2456 дн (срок наблюдения) (96). Инактивация вируса физическими средствами зависит от среды, содержащей вирус. В культуральной жидкости инфекционность теряется через 10 мин при 60°С, тогда как в де- фибринированной крови вирус не инактивируется в течение 30 мин при 68°С. Вирус стабилен при pH 5-10, но при значениях выше и ниже указанных теряет инфекционность (79).

Антигенная структура, вариабельность и родство. По вирулентности различают А-, В- и С-варианты вируса. В группу А входят вирулентные эпизоотические штаммы, вызывающие у свиней всех возрастов остропротекающую болезнь, а также лапиниз ированн ые и “холодные” варианты культурального вируса. Вирусы подгруппы В вирулентны только для поросят и при циркуляции в стаде вызывают т.н. атипичную или хроническую чуму. К подгруппе С относится американский слабовирулентный шт. 331 (20, 21, 22). Достоверных данных в отношение АГ-вариабельности вируса нет. Это подтверждается высокой эффективностью вакцин из шт. SFA (АСВ) и К в различных зонах земного шара. Заметное АГ- различие представлено среди различных штаммов ВКЧС (45). Основываясь на реакциях с монАТ были выделены АГ группы. Даже внутри некоторых штаммов ВКЧС имелась гетерогенность. Наблюдалось отсутствие связи между АГ группами и вирулентностью (81, 82, 83, 84). Полевые изоляты, которые нейтрализовывались в большей степени ВД-БС-АТ, чем ВКЧС-АТ, имели пониженную вирулентность (80).

Вариабельность вируса проявляется не только различной вирулентностью для свиней, но и различными АГ взаимоотношениями с вирусом диареи КРС. Установлено одностороннее родство между ВКЧС и вирусом диареи КРС: АТ к вирусу диареи КРС нейтрализуют ВКЧС, но АТ к ВКЧС не нейтрализуют вируса диареи (44, 48, 66).

Локализация вируса. Вирус пантропен, накапливается во всех органах и тканях, но преимущественно в лимфоузлах, костном мозге, слизистой оболочке кишечника и эндотелии кровеносных сосудов. Он проникает в организм через кишечный и дыхательный тракты. В тонзиллярных лимфоузлах отмечается наибольшая его концентрация. Возбудитель размножается в лейкоцитах периферической крови. Через 6-10 ч после попадания в организм его можно обнаружить в крови. На 3-й день после подъема температуры тела накапливается там в максимальной концентрации. У поросят, зараженных экспериментально per os, через 7 ч вирус выделяли из миндалин, а через 16 ч - из крови. С 3-го по 7-й день титр вируса, выделяемого из миндалин, крови и селезенки, был наивысшим и составлял 105 БОЕ/мл. В околоушной и поджелудочной железах, подчелюстных, заглоточных, мезентериальных и других лимфоузлах, респираторных путях и кишечном тракте вирус обнаруживали на 3-й день; в ЦНС, сердце, костном мозге, яичниках, матке - на 4-й день после заражения в титрах 103’2-105 БОЕ/мл. Он выявлен также в эпителии миндалин, в слизистой оболочке глотки, почек, мочевого и желчного пузыря, в поджелудочной железе, слюнных железах, надпочечниках, щитовидной железе. В легких вирус локализовался в эндотелии кровеносных сосудов и адвентиции, а также в альвеолярных макрофагах. На 6-й день после заражения вирус из организма больных свиней выделяется с мочой, фекалиями, истечениями из носа и глаз. Вирусовыделение начинается в инкубационном периоде и усиливается по мере развития признаков болезни. Выделение вируса прекращается уже через 3 дн после исчезновения лихорадки, однако имеются данные о том, что у хронически больных животных ви- русоносительство обнаруживают до 95-го дн после заражения.

Доказана трансплацентарная передача ВКЧС в различные периоды супоросности. Поросята после рождения длительное время остаются скрытыми вирусоносителями и служат источником заражения. Свиноматки-носители вируса рождают клинически здоровых, но инфицированных и иммунотолерантных поросят, которые выделяют вирус в больших количе- вах в течение 4-6 мес (73, 74). Этот феномен и случаи хронической инфекции являются факторами персистенции вируса среди популяции свиней (20). Трансплацентарная передача вируса сопровождается тератогенным действием и высокой перинатальной смертностью. Уровень летальности среди новорожденных поросят находится в прямой зависимости от инфицированности плодов. Все поросята с виремией в конечном счете погибают (57).

Антигенная активность. В сыворотке крови свиней-реконвалесцентов на обнаруживают ВНА, ПА и КСА. Получены монАТ, специфичные к 3-м структурным вирусным протеинам: РТ2, Р150 и Р12. АТ реагировали только с высоко очищенным вирусом. Выраженный иммунитет развивается у свиней, начиная с 6-Е-нед возраста, ВНА появляются на 7-10- й день после инфицирования или иммунизации, достигают максимума через 3-4 нед и сохраняются более года (8). Пассивные АТ у поросят могут сохраняться 2-3 мес. АТ молозива к ВКЧС, продуцированные свиньями, вакцинированными за 55 дн до опороса, характеризовались высокой активностью и коротким периодом полураспада, но подавляли первичную яммунную реакцию потомства на последующую вакцинацию. У свиноматок, вакцинирован- шх не ранее, чем за 86 дн до опороса, они обладали значительной авидностью (43).

Экспериментальная инфекция. Легко воспроизводится на неиммунных подсвинках нассой 40-50 кг при подкожном заражении.

Культивирование. Культивирование вируса в лабораторных условиях на неиммунных свиньях можно проводить практически бесконечно. Этот метод дорог и небезопасен. Вирус удается репродуцировать также в первичной культуре клеток легких, селезенки, почки и лейкоцитов без выраженного ЦПД. Оптимальный возраст культуры свиных лейкоцитов колеблется от 1 до 5 сут. Максимального уровня титр вируса достигает через 4-8 дн после заражения. Уровень репродукции различных штаммов вируса в культурах макрофагов ин- тактных н иммунизированных поросят одинаков. Он так же размножается в культуре клеток тестикул поросят, вызывая ЦПД при использовании аргинин буферной среды, и в перевиваемой линии клеток почки поросенка (РК-15). При 39-40°С вирулентные штаммы в этой культуре клеток активно репродуцируются, образуя большие флюоресцирующие участки клеток. Вакцинные штаммы в культуре РК-15 размножаются медленно при 33-34°С, образуя небольшие флюоресцирующие участки клеток. В клетках указанной линии титр его достигает 107-108 БОЕ/мл и цикл репликации длится 15-16 ч. Большое количество вновь образующегося вируса связано с клетками или адсорбировано на них, и только 1% инфекционных вирионов находится в жидкой фазе. Максимальные титры вируса (шт. Ши-Мынь) в культуре клеток РК-15 отмечали на 2-5-е сут (5,25-6,26 lg ИД5о/мл). Вакцинный шт. ЛК- ВНИИВВиМ максимально накапливался только на 4-5-е сут и титр его был одинаков (24).

Вирус хорошо репродуцируется в культуре клеток почки мини-свиней. Оптимальным методом выращивания культурального вируса (шт. JIK-ВНИИВВиМ и Ши-Мынь) оказалась роллерная технология (34). Разработана методика культивирования вируса КЧС в культуре клеток лимфомы свиней. Установлена пестивирусная контаминация некоторых перевиваемых культур свиного происхождения (31). Изучено накопление персистирующего вируса- контаминанта КЧС в перевиваемой культуре клеток ППК-666 и разработана методика деконтаминации ее путем, во-первых, культивирования монослоя клеток с сывороткой крови, содержащей высокие дозы ВНА, во-вторых, клонированием и реклонированием культуры клеток. Таким образом, была показана перспектива деконтаминации перевиваемой культуры ППК-666 от вируса-контаминанта КЧС (29). Установлена корреляция между вирулентностью штаммов ВКЧС и их способностью размножаться в культуре альвеолярных макрофагов. Культура лейкоцитов свиней более чувствительна к вирусу, чем РК-15. Вирулентные штаммы размножаются в условиях одиночного цикла (one step cycle) роста только при повышенной температуре (39-40°С). Для репродукции вируса оптимальной является температура 39°С. Аналогичные штаммы хорошо размножаются in vitro и при температуре 37°С. Только аттенуированные штаммы способны размножаться при 22° С, поэтому их репродукция in vitro может лимитироваться относительно высокой температурой тела свиней.

Точно определить инфекционную активность вируса можно методом флюоресцирующих бляшек, поскольку инфекционные титры воспроизводимы и могут быть определены уже через 24 ч после инфицирования культуры. Разработан метод титрования вируса путем учета негативных колоний под агаровым покрытием. Подобраны 3 линии клеток, формирующих негативные колонии при культивировании в монослое: РК15, ЯРД 10 и RPTY. Предложен также метод титрования ВКЧС в культуре клеток с помощью феномена экзальтации. Вначале культуру инфицируют ВКЧС, а затем (через определенное время) - вирусом НБ (шг. Миадера). Клетки, в которых размножился ВКЧС, под влиянием вируса НБ разрушаются (ЦПД), тогда как клетки, зараженные одним ВКЧС, не изменяются. Вместо вируса НБ можно использовать вирус болезни Тешена. Кроме того, предложен тест экзальтации гемагглю- тинации и ингибиции ЦПЭ с использованием клеток почки свиней и вируса НБ (шт. Сато). Здесь цитопатогенный вирус ингибируется в результате предварительной инокуляции ВКЧС; эта ингибиция сопровождается значительным увеличением образования ГА вируса НБ. Вместо последнего успешно применяли один из штаммов вируса гриппа(93) .

Помимо РК-15 во ВНИИВВиМ используют стабильные линии клеток свиного происхождения ПКПС. Исходным материалом для первичного выделения клеток служат почки 1,5- мес поросят из благополучного по КЧС хозяйства. Культура ПКПС оказалась чувствительной к вакцинному (шт. ЛК-ВНИИВВиМ) и эпизоотическому (шт. Ши-Мынь) штаммам (88). Приемлемой для промышленного выращивания ВКЧС оказалась перевиваемая линия клеток почки эмбриона кролика (ПЭКр) (18). Шт. ЛК-К ВКЧС накапливался в суспензионной культуре клеток ПСГК до 5-7 lg ККИД 50/мл (105).

ГА- и гемадсорбирующие свойства ВКЧС - не установлены.

Тератогенные свойства. ВКЧС обладает тератогенными и др. патогенными свойствами в зависимости от стадии беременности, когда происходит встреча матери и плода с вирусом. Так, например, при инфицировании супоросных маток на 65-й день происходила гибель плодов более чем в 30% случаев. У оставшихся в живых гистерэктомированных плодов обнаруживалась виремия и отсутствовали ВНА. При заражении свиноматок между 94 и 101 дн супоросности гибели плодов не наблюдалось. Очевидно 65-й день беременности является последним сроком для установления персистентной виремии у плода (46).

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции - больные животные, выделяющие вирус во внешнюю среду с мочой, фекалиями и секретами слизистых оболочек глаз и носа, а также реконвалесценты. Здоровые свиньи, находясь в контакте с больными и пользуясь общим кормлением и водопоем, легко и быстро заражаются. Заражение происходит, главным образом, через пищеварительный тракт с инфицированными кормами и водой, а также через дыхательные пути и поврежденную кожу. Один из основных путей распространения инфекции - завоз продуктов убоя больных чумой свиней и скармливание их животным без надлежащего обезвреживания, а также ввоз в хозяйство свиней в инкубационном периоде болезни и вирусоносителей, занос вируса с грубыми и сочными кормами, зараженными дикими свиньями.

Из неблагополучных хозяйств ВКЧС свободно выносится за 2 нед до появления болезни и после начала ее до установления диагноза, когда животных без ограничения вывозят на мясокомбинаты и в другие хозяйства. Реализация продуктов убоя таких свиней - главная причина распространения чумы в современных условиях. Описана передача ВКЧС комарами. Примерно из 100 комаров разных видов, отловленных в двух неблагополучных по КЧС фермах, готовили суспензии и заражали поросят. В 8 случаях поросята заболевали. Патогенной оказалась суспензия комаров из родов Aedes, Anopheles, Psorophora и Culex (20, 67).

Наиболее важным аспектом в циркуляции вируса КЧС в природе является трансплацентарная передача полевых и вакцинных штаммов, врожденная персистентная КЧС-инфекция у плодов и новорожденных поросят. Прослеживается тесная связь кругооборота вируса с кругооборотом репродуктивного цикла воспроизоводства свиней. Циркуляция вируса в популяции “свиноматка - плод -потомство” является основным связующим звеном естественного кругооборота вируса (36а).

Природная очаговость. Природная очаговость КЧС среди кабанов представляет опасность для промышленного свиноводства возможным вовлечением домашних свиней в цепь циркуляции возбудителя. Появление природной очаговости чумы в стране обусловлено рядом объективных факторов: -

прямыми и косвенными связями между дикими и домашними свиньями вследствие продолжающегося расселения кабанов. Зоологи отмечают, что северная граница ареала кабанов сдвинулась на север европейской части страны до линии Беломорск - Березняки - Няндома - Котлас - Мураши. Активное расселение кабана идет и в южных районах России при устойчивой общей численности поголовья; -

устойчивостью возбудителя КЧС, длительным вирусоносительством, разнообразием путей его передачи от больных кабанов здоровым при непосредственных контактах или через объекты внешней среды, инфицированные выделениями больных животных, длительным поддержанием вируса в популяциях благодаря конгенитальному заражению плодов; -

антропогенным воздействием на среду обитания кабанов, приводящим к вынужденному использованию ими кормов, пищевых отходов, подстилки на полях и фермах и взаимному обмену вирулентным вирусом при наличии больных среди диких и домашних свиней; -

связывающими факторами в распространении возбудителя КЧС между отдельными популяциями кабанов в результате миграции животных (суточный переход достигает 10-20 км). Не исключена в этом процессе роль кровососущих членистоногих. Дополнительным, нередко важным, связующим звеном с домашними свиньями могут быть пищевые отходы вследствие использования человеком мяса кабанов.

Результаты эпизоотологического анализа и исследования материала во ВНИИВВиМ по выделению ВКЧС от павших и отстреляных кабанов показали, что болезнь среди кабанов регистрировали с 1901г. (Беловежская Пуща) и в течение последующего периода. Диагноз на чуму до разработки лабораторного метода диагностики ставился на основе комплекса признаков, что часто используется в современной практике. Чума среди кабанов появлялась и распространялась постепенно через определенные промежутки времени и возникала вновь зачастую в одних и тех же регионах. В течение 1964-1977 гг. чуму регистрировали поочередно в Белоруссии, Молдавии, Западной Украине, Центральной России, Северном Кавказе и Приморье. Новая волна КЧС в 1986-1989 гг. охватила Молдавию, Одесскую, Черновицкую и др. области Украины. В 1990-1991 гг. случаи распространения КЧС среди кабанов, а затем и домашних свиней установлены в Брянской, Тверской, Смоленской, Московской, Курской и др. областях. Продолжают оставаться неблагополучными по чуме кабанов Приморье, Забайкалье, Бурятия. В Приморском крае чума также широко распространена в хозяйствах 12-ти районов. Основываясь на многократных фактах выявления больных и павших кабанов, можно предполагать неблагополучие по КЧС в Днестровско-Бугском междуречье, Дунайских плавнях, Закарпатье, Беловежском лесном массиве, Приморье. Имеется такая же вероятность для средней полосы России, Северного Кавказа. Поэтому необходим регулярный эпизоотологический надзор за дикими кабанами и усовершенствование системы его проведения (10).

Помимо отечественных работ имеется сообщение Я. КгаБ5т? е1а1. (50) о том, что ряд вспышек КЧС в 1990 г. в Австрии привел также к инфицированию диких кабанов в северо- восточной части страны (в Федеральной земле Нижняя Австрия). Одной из наиболее важных причин вспышек болезни является поедание пищевых отходов. Серологические исследования домашних свиней в Штирии и диких кабанов в Нижней Австрии показали, что инфекция может не вызывать гибели животных, а также развития типичных клинических симптомов. Инфицированные свиньи, как правило выживают. Вакцинация в Австрии запрещена. Кроме того, установлено, что имеющие недостаточный иммунитет супоросные свиноматки, инфицированные вирусом чумы свиней разной вирулентности, в случае заноса инфекции являются основным источником вируса для новорожденных, играют важную роль в его поддержании и распространении (9).

Спектр патогенности в естественных условиях. К ВКЧС восприимчивы домашние свиньи всех пород и возрастных групп, особенно чистопородные, а также дикие кабаны. В лабораторных условиях путем длительных серийных пассажей ВКЧС удается адаптировать к организму кроликов (20, 21).

ДИАГНОСТИКА

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований. Эпизоотические, клинические и патологоанатомические данные зависят от восприимчивости свиней, виру- лентности штамма и комплекса мероприятий по профилактике КЧС.

Если в очаге штамм вируса вирулентный, поголовье свиней не иммунное, то болезнь характеризуется высокой контагиозностью, большей смертностью, гипертермией, геморрагическими поражениями кожного покрова, признаками поражения органов ЖКТ и ЦНС. Обращают внимание выраженный геморрагический диатез в различных органах, мрамор- ностъ лимфоузлов, инфаркты селезенки, кровоизлияния в почках на фоне их анемни, катарально-геморрагический гастроэнтерит, лимфоцитарный энцефаломиелит. Однако частая вакцинация свнней против чумы создает иммунный фон, влияющий на симптомы болезни и характер патоморфологических изменений. При хроническом течении характерными изменениями являются очаговый дифтеритический налет (бутоны), коричневая экзема, фибринозный плеврит и перикардит, некроз миндалин. Хроническая болезнь часто протекает на фоне других инфекций. Правильный диагноз может быть поставлен только лабораторными методами (20).

Экспресс-методы обнаружения вируса КЧС. Рекомендована дифференциация пести- вирусов с использованием ДНК-зонда на ВКЧС. В качестве гибридизационного зонда используют комплементарную ДНК (меченую 32Р) к участку гена белка Р125 (71). Для быстрого обнаружения ВКЧС в тканях с помощью ПЦР из образцов тканей животных фенольным методом выделяют препараты РНК, подвергают обратной транскрипции и амплифицируют в ПЦР. Используемые “гнездовые” праймеры позволяют амплифицировать разные изоляты ВКЧС (53). ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет дифференцировать различные пестивирусы (38а, 47а, 54а, 85а). Предложен вариант ПЦР для выявления ВКЧС с использованием 4-х праймеров для амплификации фрагментов гена белка Е1. Чувствительность метода составляет 10 ТЦД50 (90).

Выделение вируса.

Взятие и подготовка материала. Для выделения вируса берут пробы крови, кусочки селезенки, миндалин, лимфоузлов, грудной кости, почек и легких от 2-3 животных в первые 2 ч после гибели или убоя больных в агональном состоянии. Материал отбирают в стерильные флаконы, закрывают резиновыми пробками, флаконы обрабатывают снаружи 5%-ным р-ром хлорамина или осветленным 20%-ным р-ром хлорной извести, обертывают марлей, смоченной дезинфицирующим р-ром, и помещают в полиэтиленовый пакет. Взятый патма- териал помещают в термос со льдом, опечатывают и отправляют с нарочным в лабораторию с соответствующим сопроводительным документом. В лаборатории из каждой пробы готовят 20%-ную суспензию на 0,85%-ном р-ре ЫаС1, которую трижды замораживают и оттаивают, центрифугируют при 3-4 тыс. мин'1 20-30 мин. Надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками 1ч при 37°С и используют для выделения вируса.

Выделение вируса в культуре клеток. Используют перевиваемую культуру клеток РК-15, выращенную на стеклянных пластинках. На каждую пробу материала берут не менее 8 пробирок, в которые вносят по 0,4 мл исследуемого материала. Адсорбируют вирус 2 ч при 37°С, затем его удаляют, клетки отмывают средой и заливают 2 мл поддерживающей среды с 2% сыворотки теленка. Для контроля качества культуры клеток оставляют 10 пробирок незаряженными. Инкубируют 24-96 ч. ВКЧС в культуре клеток РК-15 не вызывает ЦПД, поэтому индикацию его проводят методом прямой ИФ. Через 24-96 ч после инокуляции пластинки с монослоем клеток извлекают из пробирок, подсушивают на воздухе и 10 мин фиксируют в холодном (4°С) ацетоне, подсушивают на воздухе и помещают их клетками вниз на капле ФИТЦ-1? ВКЧС, нанесенного в рабочем разведении на предметные стекла. Препараты выдерживают во влажной камере 30 мин при 37°С, затем промывают в сосуде с 0,01 М ФСБ с pH 7,2-7,5 30-40 мин в темном месте, ополаскивают в дистиллированной воде, подсушивают на воздухе и заключают в забуференный глицерин (9 частей глицерина и 1 часть 0,01 М ФСБ с pH 7,5). Для этого на обезжиренное предметное стекло наносят каплю забуференного глицерина, помещают препарат клетками вниз и заливают края расплавленным парафином. Просматривают под люминесцентным микроскопом (20, 21).

В инфицированных препаратах, обработанных ФИТЦ-Ig, АГ вируса обнаруживают по ярко-зеленому диффузному свечению цитоплазмы пораженных клеток, располагающихся группами, которые называют флюоресцирующими микробляшками. Через 24-48 ч в культуре клеток РК-15 наблюдают появление микробляшек. При их отсутствии в первом пассаже проводят 2-й и 3-й пассажи испытуемого материала с последующим ИФ через 24-96 ч (64).

Индикация и идентификация вируса

Гистологические исследования. Проводят с целью обнаружения специфических изменений нервных тканей. От павших или убитых свиней берут кусочки полушария головного мозга, мозжечка, аммоновых рогов, спинного мозга в различных участках. Гистологические препараты окрашивают гематоксилин-эозином. В большинстве случаев (70-93%) в ЦНС обнаруживают негнойный лимфоцитарный энцефаломиелит, характеризующийся периваску- лярными лимфоцитарными инфильтратами, очаговой пролиферацией клеток микроглии (глиальных узелков) и дистрофией ганглиозных клеток. В срезах, приготовленных из лимфоузлов, сердечной мышцы и печени, можно обнаружить присутствие ацидофильных внутриядерных телец-включений, несколько меньших, чем ядрышки. В лимфоузлах их находят на 6-12-й день после заражения.

ВКЧС обладает выраженным гематотропизмом в отношении костного мозга, содержащего большее количество бластных клеток, чем лимфоузлы и селезенка. Поэтому костный мозг поражается первым; ингибируются миелопоэтические и эритропоэтические клетки и пролиферируют крупные клетки с базофильной цитоплазмой. Наряду с этим обнаруживают картину глубокого цитолиза и дистрофию лимфопоэтических органов.

При подозрении на чуму для уточнения диагноза несколько тяжелобольных животных убивают и исследуют мазки из костного мозга грудной клетки.

Биопроба. Из благополучного по инфекционным болезням хозяйства берут поросят в возрасте 2-3 мес массой 20-30 кг. В качестве материала используют 10%-ную суспензию, приготовленную из органов (селезенки, лимфоузлов, костного мозга) или крови от павших животных. Суспензию обрабатывают антибиотиками, выдерживают не менее 4 ч при 4°С, центрифугируют и надосадочную жидкость используют для заражения животных. Трем поросятам вводят подкожно по 1 мл крови или по 2 мл суспензии органов. Двум животным исследуемый материал не инокулируют, содержат их отдельно для контроля. Двум поросятам, иммунным к ВКЧС, вводят исследуемый материал в тех же дозах с целью дифференциальной диагностики в отношении АЧС. За всеми животными наблюдают 21 день и ежедневно измеряют температуру тела (20).

Диагноз считают положительным, если 2 из 3-х неиммунных поросят заболевают, проявляя симптомы болезни, и погибают, а 2 иммунных остаются здоровыми или проявляют незначительные и кратковременные (1-4 дн) признаки болезни слабой интенсивности (повышение температуры тела не выше 41°С). Однако следует иметь ввиду, что при отсутствии реакции у восприимчивых животных или в случае ее недостаточной выраженности, нельзя с уверенностью исключить присутствие вируса в исследуемом материале. Отрицательный результат заражения может быть следствием либо слишком малого количества в нем вируса, либо слабой вирулентности последнего. Поэтому следующим шагом является повторное, спустя 3-6 нед после инокуляции исследуемого материала, заражение (реинфек ция) подопытных свиней на этот раз вирусом с заведомо известной вирулентностью. Отсутствие у животных реакции на это заражение свидетельствует о приобретении ими иммунитета в результате первой инокуляции (бессимптомного переболевания) и косвенно указывает на присутствие вируса в исследуемом материале. Одновременно с проведением второй пробы заражают дополнительно двух восприимчивых поросят (контроль) вирусом, использованным для реинфекции.

Иногда биологическая проба себя не оправдывает или дает неясные результаты при выделении штаммов вируса, вызывающих легкое заболевание. Такие штаммы у инокулиро- ванных поросят вызывают хроническую болезнь. Дело осложняется тем, что штаммы со слабой вирулентностью могут не обладать иммунизирующими свойствами, а это не позволяет уточнить диагноз при использовании дополнительного контрольного заражения вирулентным штаммом (реинфекции). При диагностике заболевания, обусловленного такими штаммами могут понадобиться более молодые животные и дополнительные пассажи для повышения вирулентности (20).

Предложена шкала оценки вирулентности полевых штаммов ВКЧС: -

слабовирулентные (патогенные лишь для поросят-сосунов) не иммунизирующие штаммы. Поросята-сосуны заболевают в первые дни жизни и смертность их велика, порося- та-отъемыши (12-15 кг) реагируют только в определенные дни подъемом температуры тела, не приобретая иммунитета; -

слабовирулентиые (патогенные для молодых животных) иммунизирующие штаммы. У животных массой 15-20 кг развивается хроническая болезнь, подсвинки массой 35 кг реагируют подъемом температуры тела, продолжающимся несколько дней. На вскрытии обнаруживаются незначительные точечные кровоизлияния. Животные приобретают иммунитет; -

сильно вирулентные штаммы вызывают у животных массой 30 кг острое заболевание, смертность 40% и больше. На вскрытии характерны геморрагические изменения.

Тест модуляции фагоцитарной активности макрофагов. Дефицит фагоцитарной функции приводит к нарушению локальных иммунных реакций с развитием воспалительных процессов на слизистых оболочках. При КЧС происходит локализация фагоцитарной функции лейкоцитов: при репродукции вакцинного шт. JIK-ВНИВВиМ снижается процент и индекс фагоцитоза нейтрофилов и макрофагов, а при репродукции вирулентного вируса шт. Ши-Мынь повышается процент и индекс фагоцитоза нейтрофилов и снижается таковой у макрофагов. При КЧС in vivo и in vitro фагоцитарная активность лейкоцитов крови кратковременно (до 4 сут) снижается при инфицировании вакцинным штаммом и повышается у макрофагов при инфицировании вирулентным штаммом ВКЧС. Установленный в инфицированных клетках-мишенях цитопатический эффект, выражающийся в модуляции фагоцитарной активности свиных макрофагов, используют в диагностике КЧС (33).

Серологическая идентификация

Иммунофлюоресценция. Из проб органов (лимфоузлы, селезенка, почки, миндалины) готовят замороженные срезы. Из проб костного мозга и лейкоцитарного концентрата - мазки. Для приготовления последних берут грудную кость, делают продольный разрез и вынимают красный костный мозг, из которого делают несколько мазков. Для приготовления мазков из лейкоцитарного концентрата от больных или подозреваемых в заболевании свиней берут 15 мл крови с антикоагулянтом, энергично встряхивают, оставляют на 1 ч при комнатной температуре, затем отбирают плазму с лейкоцитами и центрифугируют 10 мин при 1000 мин'1, из осадка лейкоцитов (беловатый осадок) делают 2-3 мазка. Приготовленные препараты (срезы и мазки) фиксируют в охлажденном ацетоне 10 мин, после испарения ацетона промывают 15-20 мин в ФБР pH 7,2 и окрашивают при 37°С 30 мин конъюгатом в рабочем разведении, к которому добавляют краситель Эванса в соотношении: 3 части конъюгата и 1 часть красителя, затем препарат промывают в фосфатном буфере и оставляют на 10 мии в дистиллированной воде. После частичного подсушивания на воздухе на препарат наносят забуференный глицерин (9 частей глицерина и 1 часть ФБР pH 8), покрывают покровным стеклом и микроскопируют (20). Аналогично ставят контроли: а) исследуемый материал и нормальный конъюгат с красителем Эванса; б) неинфицированный материал и специфический конъюгат с красителем Эванса.

При микроскопии фон препарата флюоресцирует красно-оранжевым цветом, ядра клеток темные, специфическое свечение характеризуется зеленым цветом цитоплазмы. В мазках из красного костного мозга и лейкоцитарного концентрата специфическая флюоресценция отличается большой яркостью и количеством флюоресцирующих клеток. Специфическое свечение в цитоплазме даже в отдельных клетках препаратов, полученных от подозрительных по заболеванию животных, указывает на наличие вируса КЧС. В контрольных препаратах подобного свечения не должно быть.

Указанный метод отличается специфичностью и быстротой. Однако во избежание погрешностей метода при внедрении его в лаборатории следует иметь в виду, что специфичность результатов зависит от следующих факторов: качества сыворотки-маркера (она должна иметь высокие титры, быть моновалентной, полученной от свиней, не обработанных другими АГ), качества исследуемого материала (должен быть отобран не позже 2-3 ч после смерти животного, фиксирован в ацетоне или замораживанием и сразу же отправлен на исследование). В сопроводительном письме необходимо указывать клиническую и эпизоото- логическую характеристику болезни, даты и названия прививок. При учете реакции следует иметь ввиду, что вакцинный вирус сохраняется в организме вакцинированных свиней до 15 дн после вакцинации и в ИФ не дифференцируется от полевого вируса.

В Болгарии (12, 13,14) для ИФ диагностики КЧС из вены больных животных получают кровь, готовят препараты лимфоцитов и лизированных эритроцитов и вносят их в пробирки с пластинками, содержащими культуру клеток СПЭВ. Через определенные промежутки времени пластинки извлекают и подвергают ИФ-обработке для выявления АГ вируса. Первые признаки размножения вируса в клеточном монослое выявляются через 12 ч после заражения. Максимального развития признаки достигают через 48-72 ч. Ценность прямого метода ИФ повышается при использовании его для прижизненной диагностики путем исследования биопсированных миндалин. В Японии с этой целью сконструирован прибор.

Установлено преимущество метода для идентификации АГ вируса с использованием культуры клеток РК-15 по сравнению с исследованием гистопрепаратов или мазков- отпечатков. В случае исследования органов свиней, иммунизированных вирус-вакцинами, когда АГ вакцинного вируса еще можно обнаружить в мазках-отпечатках, существует реальная возможность получения ложноположительных результатов. Поэтому для идентификации изолятов ВКЧС чаще применяют метод флюоресцирующих АТ в культуре клеток РК- 15, который, несмотря на трудоемкость, характеризуется большей чувствительностью и легкостью учета результатов по сравнению с выявлением АГ в срезах ткани. Через 24-48 ч после заражения обнаруживали флюоресцирующие микробляшки из 5-30 клеток.

При помощи метода ИФ в сочетании с методом культуры клеток удается диагностировать чуму почти у всех больных свиней. В таком сочетании метод позволяет обнаружить ВКЧС и в мясе вынужденно убитых животных. Для обнаружения АГ вируса в миндалинах наиболее эффективен метод непрямой ИФ с контрастированием синькой Эванса.

РНГА. Для обнаружения АГ вируса в патологическом материале из органов и тканей свиней используют следующие компоненты: а) АТ-эритроцитарный диагностикум; б) специфический АГ - вирус-вакцина КЧС; в) нормальный (контрольный) АГ; г) 1%-ный р-р нормальной лошадиной сыворотки в забуференном физиологическом р-ре с pH 7,2; д) фор- малинизированные и танизированные эритроциты барана; е) исследуемый материал ( 96а).

РНГА ставят микрометодом в объеме 0,075 мл с помощью аппарата Такачи или Титер- тек. Готовят двукратные разведения исследуемого материала (от 1:2 до 1:512) в объеме 0,05 мл и такие же разведения контрольных АГ (специфического и нормального). Затем во все луночки вносят 0,025 мл 3%-ной суспензии эритроцитарного диагностикума. Кроме того, ставят дополнительно контроли; а) 0,05 мл 1%-ного р-ра нормальной сыворотки лошади и 0,

025 мл эритроцитарного диагностикума; б) 0,05 мл исследуемого материала в разведениях и 0,025 мл формалинизированных и танизированных эритроцитов. После этого пластинки встряхивают и оставляют на 1,5-2 ч при комнатной температуре. Учет реакции проводят в крестах по 4-бальной системе. РНГА считают положительной при обнаружении агглютинации не менее чем иа три креста в разведениях 1:8 и выше (96а).

РДП и ИЭОФ. Реакции различаются методами получения линий преципитации: в РДП это происходит посредством свободной диффузии р-ров АГ и АТ из лунок в агаровом геле равномерно во все стороны, а в ИЭОФ АГ и АТ движутся строго навстречу друг другу под действием электрического поля, в результате чего увеличивается их концентрация в месте встречи и там образуются более выраженные полосы преципитации.

Для постановки ИЭОФ необходим специальный прибор для электрофореза, дающий регулируемое напряжение постоянного тока до 300В. ИЭОФ в несколько раз чувствительнее метода РДП, требует незначительного количества материала и позволяет получать результаты через 30 мин (6). Метод стандартизован, описана методика приготовления агарозного геля. Он используется для выявления АГ ВКЧС в мезентериальных лимфоузлах и суспензии ткани поджелудочной железы при клинических случаях болезни. Помимо АГ, данный метод позволяет выявлять и специфические АТ. Метод быстрый, легко осуществим и более чувствителен для лабораторной диагностики КЧС, чем РДП.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика

В настоящее время в лабораторной диагностике КЧС используются три метода обнаружения специфических АТ к ВКЧС: реакция нейтрализации флюоресцирующих микробляшек (РНФБ), реакция непрямой ИФ и непрямой вариант твердофазного ИФА. Наиболее эффективными методами обнаружения специфических АТ к ВКЧС являются РНФБ и ИФА. Эффективность обнаружения АТ к ВКЧС в ИФА по сравнению с РНФБ составляла 96,5%. На основании этих данных непрямой вариант ИФА рекомендован для обнаружения специфических АТ к ВКЧС (40,96а).

НИФ. НИФ применяется для выявления и титрования АТ в сыворотках крови переболевших свиней. Используют зараженные вирусом перевиваемые клетки (РК-15) на стеклышках, на которых титруют испытуемые сыворотки в 2-кратных разведениях от 1:20 до 1:640 в непрямой ИФ по общепринятой методике с использованием во втором этапе реакции антисвиного ФИТЦ-^. Титром АТ к КЧС считают последнее разведение сыворотки, обеспечивающее зеленое свечение (на 2 креста) диффузного цитоплазматического АГ вируса при отсутствии подобного свечения в контролях с интактиыми тест-объектами и нормальной свиной сывороткой.

Реакция нейтрализации флюоресцирующих бляшек (РНФБ). В качестве чувствительной системы необходимо использовать перевиваемую культуру клеток РК-15, выращенную на покровных стеклах в пробирках. РНФБ проводят микрометодом, используя пластиковые панели ТиеПек, Суспензию клеток (в 1 мл 10-800 тыс. клеток) готовят на среде Игла (МЕМ) с 5% фетальной сыворотки крови КРС с добавлением буфера НЕРЕБ. Постановка микрометодом РНФБ более производительна, чем использование макрометода (28). Данный метод может успешно применяться и для титрования специфических АТ (20, 26). Пробы сывороток крови берут от животных не ранее 15 дн после клинического выздоровления. Перед использованием их инактивируют при 56°С 30 мин. Сыворотки разводят от 1:2 до 1:2560 и смешивают с равным объемом вакцинного вируса в количестве 100 ККИД50 (клеточно-культуральных инфекционных доз), встряхивают и выдерживают 60 мин при 37°С. Каждое разведение сыворотки с вирусом вносят по 0,4 мл в 4 пробирки с культурой клеток РК-15 на стеклышках. Адсорбируют 2 ч при 37°С. Смесь сыворотка-вирус сливают, отмывают клетки средой, заливают 2 мл поддерживающей среды и инкубируют при 37°С. Реакцию учитывают через 48 ч инкубации. Препараты вынимают из пробирок, ополаскивают в 0,01 М ФБР pH 7,2-7,4 и обрабатывают, как указано выше (см. “Выделение вируса в культуре клеток”). Реакция сопровождается соответствующими контролями (смесь вируса со средой, гипериммунной и нормальной сыворотками и незараженная культура клеток). Отсутствие флюоресцирующих микробляшек (при наличии их в контроле вируса в смеси с питательной средой и нормальной сывороткой) в препаратах ВКЧС, обработанных гипериммунной и испытуемыми сыворотками в разведении 1:2 и выше, указывает на наличие в материалах специфических АТ. Титром АТ считают то предельное разведение сыворотки, при котором наблюдается полное подавление образования флюоресцирующих микробляшек.

Во избежание получения ложных результатов при использовании культуры клеток необходимо добавлять в среду бычью сыворотку, свободную от вируса диареи КРС и АТ. ВНА выявляются через 21 день после заражения. Обнаружение их с помощью непрямой ИФ в культуре клеток широко применяли в США на последних этапах программы искоренения болезни. Однако при интерпретации результатов следует учитывать частые случаи инаппа- рантной инфекции у свиней, вызванной серологически родственным вирусом диареи КРС, поэтому все положительно реагирующие сыворотки свиней необходимо исследовать и на вирус диареи.

Для массового обследования свиней на субклиническую инфекцию КЧС в ФРГ предложен тест, сочетающий PH с ИФ (20). В качестве тест-системы используют культуру клеток РК-15. Если у одной или нескольких свиноматок отдельного стада в сыворотке крови обнаруживают ВНА, всех поросят убивают с последующим исследованием органов ИФ.

При исследовании проб сывороток из неблагополучных хозяйств в PH (с 200-300 БОЕ патогенного шт. Альфорт 331) до 50% их оказалось положительными. Наличие АТ свидетельствовало о носительстве вируса. Вирус смогли выделить только у молодых поросят.

Описана усовершенствованная методика выявления ВНА к ВКЧС, в которой постановка теста значительно облегчена за счет использования цитолитического штамма вируса, выделенного из персистентно инфицированной перевиваемой культуры клеток JB-RS-2 и индуцировавшего четкое ЦПД в нескольких перевиваемых линиях клеток почки поросенка. Реакцию ставят в культуре клеток РК-15 на микропанелях при 38°С в термостатах с подачей СОг (20). По воспроизводимости и чувствительности методика не уступает реакции с использованием метода ИФ АТ, но требует значительно меньшего труда. Предлагаемый метод обладает рядом преимуществ: исключает необходимость использования ИФ; учет результатов можно проводить без микроскопа; реакцию ставят микрометодом; используемый вирус аттенуирован. Для постановки PH необходимо вначале провести титрование ВКЧС.

Титрование ВКЧС. Поскольку титрование на чувствительных подсвинках связано с экономическими трудностями, а в культуре клеток вирус не вызывает ЦПД, то для титрования используют разработанный Менлингом в 1963 г. метод ИФ зараженных серийными разведениями вируссодержащего материала культур клеток (20). Точное определение инфекционной активности вируса может быть осуществлено методом флюоресцирующих бляшек. Для этого с монослоя клеток удаляют ростовую среду и заражают каждым разведением вируса (от 10'1 до 10'6) по 0,4 мл 6 пробирок культуры клеток РК-15, выращенных на пластинках. После 2 ч инкубации в пробирки добавляют по 2 мл поддерживающей среды и инкубируют 72 ч при 37°С. Затем по 4 пластинки на каждое разведение вируса вынимают из пробирок и обрабатывают методом прямой ИФ, как указано выше (см. “Выделение вируса в культуре клеток”) (20,41).

Титром ВКЧС считают наибольшее его разведение, вызывающее образование специфического цитоплазматического АГ, выявляемого после второго пассажа вируса в культуре клеток РК-15. Титр вычисляют по методу Рида и Менча, выражая его в ККИД 50/объем. При рассмотрении такого монослоя в люминесцентном микроскопе обычно обнаруживают флюоресцирующие фокусы, состоящие из 20-30 инфицированных клеток. Число таких фокусов обычно соответствует числу инфекционных единиц в инокуляте. Такой метод имеет преимущества, так как инфекционные титры воспроизводимы и могут быть определены уже через 24 ч после инфицирования культуры; титр вируса обычно бывает высоким, точность метода удовлетворительная и результаты можно получить уже через 24 ч. Однако метод довольно сложен, чтение результатов под микроскопом при массовых исследованиях утомительно. Метод обладает тем важным преимуществом, что позволяет идентифицировать и титровать даже ослабленный, применяемый в качестве живой вакцины вирус. Установлена некоторая разница между титрами вируса по ЦПД, ИФ и титром патогенности для свиней.

ИЭОФ. Используется в 1%-ной агарозе как диагностический при выявлении АТ к ВКЧС в сыворотках зараженных свиней. Для исследования применяется АГ, экстрагированный из зараженных ВКЧС клеток РК-15. Показано, что этот культуральный АГ ВКЧС идентичен преципитирующему АГ вируса, экстрагированного из ткани селезенки зараженных свиней. Обнаружено, что ПА к ВКЧС появляются в сыворотках через 2-3 нед после заражения животных слабовирулентными штаммами или модифицированным живым вакцинным штаммом. Выявлено, что метод ИЭОФ в 2-16 раз чувствительнее, чем иммунодиф- фузия в агаровом геле. Несмотря на меньшую его чувствительность по сравнению с PH, результаты, полученные с помощью ИЭОФ, хорошо согласуются с результатами, полученными методом подавления бляшкообразования. Считается, что ПА к ВКЧС могут персистиро- вать до 3 лет после 1-кратной вакцинации шт. С. Методом ИЭОФ невозможно было дифференцировать АТ к ВКЧС от АТ к вирусу диареи КРС; при получении положительных результатов необходимо сочетать его с PH.

ИФА в непрямой модификации. На миллипоровские фильтры (тип ОН, диаметр пор 0,

3 мм), диаметр которых равен 0,6 см, смоченные р-ром АГ ВКЧС, наносят свиные сыворотки. Затем фильтры инкубируют в р-ре кроличьего IgG (против IgG свиньи), меченого пе- роксидазой хрена RZ=3,0. Активность связанной пероксидазы определяют в р-ре субстрата 3,3-диаминобензидина. Опытные образцы окрашивались в коричневый цвет, контрольные оставались бесцветными. Реакция громоздкая.

ELISA. Разработан метод определения АТ к ВКЧС на микроплатах, поддающийся автоматическому анализу (37). Описана методика получения очищенного и концентрированного АГ для теста ELISA из шт. Альфорт, размноженного в культуре клеток РК-15. Результаты ELISA и PH близки (20). ELISA легок в выполнении, дешев, позволяет быстро исследовать большое количество образцов, высокочувствителен и рекомендован в качестве метода оценки при крупномасштабных обследованиях (96а).

С использованием иммуноглобулинов баранов, инфицированных ВКЧС, разработана технология изготовления ИФ-коиъюгатов, пригодных для выявления вирусного АГ в патологическом материале. При постмортальной диагностике вирус выявляется со 100% эффективностью без биологического накопления. При экспериментальном заражении вирус в пробах мочи и крови обнаруживали через 8-10 ч, при контактном заражении - через 72-96 ч. Положительные результаты при индикации ВКЧС в объектах ветеринарного надзора (зерно, почва, вода) получены при концентрации вируса, превышающей 100 ИДзо/м^мг) (100). Показано успешное применение ИФА для выявления ВКЧС в культуре клеток РК-15 (65).

Описано получение монАТ для диагностики КЧС на мышах линии BALB/c 4-кратно иммунизированных ВКЧС (шт.Альфорт). Клетки селезенки мышей “сливали” с миеломиы- ми клетками Sp2/0. Полученные гибридомы культивировали в 20% среде ДМЕМ Ну-Нт при 37°С в атмосфере 5% СОг. Продуцирующую специфические АТ культуру дважды субклони- ровали и после определения изотипа АТ инокулировали интраперитонеально мышам BALB/c. Образующаяся асцитная жидкость содержала высокие концентрации монАТ, которые после соответствующей очистки конъюгировали пероксидазой хрена (40,55).

Разработан способ изготовления иммуноферментных конъюгатов для ИФА с использованием монАТ к ВКЧС с сохранением активности фермента и высокой специфической активностью иммуноглобулина (91, 92), а также метод флюоресцирующих зондов (МФЗ), который не уступал по чувствительности и специфичности МФА. Разработан метод выявления ВКЧС методом молекулярной гибридизации и ПЦР (89,90).

Дифференциальная диагностика

КЧС необходимо отличать от африканской чумы, пастереллеза, сальмонеллеза, рожи, БА, ВД-БС, парагриппа и гриппа. При африканской чуме ярче выражен геморрагический диатез, увеличена и размягчена селезенка, полнокровие и кровоизлияния в почках. Чаще поражаются, имея вид кровяных сгустков, портальные, почечные и брыжеечные лимфоузлы. Сильно выражен отек интерстициальной ткани легких, скопление в грудной полости кровянистой жидкости. Редко отмечают инфаркт селезенки, постоянно - тотальный распад лимфоцитов и тканей лимфоидных органов. Для дифференциации ставят тест перекрестного иммунитета, тест гемадсорбции и РИФ (20).

Пастереллез, как правило, не принимает характера эпизоотии, поражает преимущественно взрослых животных. Для него характерны отек подкожной клетчатки подчелюстного пространства, распространяющийся на шею и глотку, серозный лимфаденит, фибринозно- некротизирующая пневмония, слабо выраженный геморрагический диатез. Кроме того, обнаруживают возбудителя при бактериологическом и биологическом исследованиях.

Рожа обычно возникает в летний период года и характеризуется застойными явлениями кожи (рожистая эритема) и во внутренних органах, увеличением селезенки, гломерулонеф- ритом и катаральным гастроэнтеритом. Рожу свиней диагностируют выделением возбудителя. Не исключено одновременное течение чумы и рожи. В этом случае диагноз ставят на основании биологической пробы на чуму и бактериологического исследования на рожу.

Сальмонеллез наблюдают спорадически и энзоотически среди молодняка 1-5-мес возраста. Характеризуется слабым геморрагическим диатезом, развитием в толстом кишечнике плоских рыхлых струпьев и язв, а не “бутонов”, очаговыми некрозами печени. Результаты бактериологических исследований являются также основанием для дифференциации КЧС.

Грипп и парагрипп свиней исключаются вирусологическим исследованием материала, взятого из верхних дыхательных путей (наличие Г А вируссодержащего материала в первых пассажах на КЭ, гемадсорбции в культуре ткани, цитоплазматических включений при ри- ноцитоскопии). Болезнь Ауески чаще наблюдается среди поросят. Проводят вирусологические исследования и биопробу на кроликах. Вирусную диарею у инфицированных свиней устанавливают с помощью ПЦР, поскольку большой неструктурный протеин пестивирусов 125 кД высоко консервативен, а мажорный протеин конверта {*т53 четко различается у ВКЧС и диареи КРС (52).